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Structural and enzymatic features of a recombinant &beta;-fructofuranosidase from <i>Bifidobacterium adolescentis</i> (2016)

  • Authors:
  • Autor USP: MERA, ALAIN EDUARD MONSALVE - IFSC
  • Unidade: IFSC
  • Sigla do Departamento: FCI
  • Subjects: PROTEÍNAS; CRISTALOGRAFIA; ENZIMAS; BACTÉRIAS
  • Keywords: &beta;-fructofuranosidase; &beta;-frutofuranosidase; <i>Bifidobacterium adolescentis</i>; Crystal structure; Estrutura cristalográfica; GH32
  • Language: Inglês
  • Abstract: O presente trabalho disserta sobre os estudos das propriedades bioquímicas e as características estruturais de uma &beta;-frutofuranosidase recombinante (BaFFse) da bactéria Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 (gen BAD_1325) presente em intestinos saudáveis. A proteína foi expressa heterologamente em Escherichia coli Rosetta. A enzima foi purificada por cromatografia de afinidade (íons de níquel) e cromatografia de exclusão por massa molecular; o processo de purificação foi avaliado por gel desnaturante tipo SDS-PAGE. A sacarose foi usada como substrato para os ensaios de atividade enzimática e a quantidade de açúcares redutores, detectados por ácido dinitrosalicílico, foi tomada como indicador das condições ótimas de hidrólise para a enzima. Cristais de BaFFase, crescidos em solução contendo PEG 8 k em tampão Hepes pH 6,5, foram difratados a uma resolução de 2,44 &Aring; e processados utilizando o pacote de programas CCP4. A enzima apresentou um clássico enovelamento tipo composto por cinco pás de quatro-fitas &beta; cada e um domínio C-terminal sanduíche-&beta; característico da família GH32; no entanto, ligado ao &beta;-propeller, através de um loop de 38 resíduos, a BaFFase apresentou um inédito domínio N-terminal sanduíche-&beta; (resíduos 3-100 de BaFFase) ainda sem precedentes, quando alinhado contra a base de dados PDB. Ensaios de gel filtração, DLS e SAXS mostraram que a enzima se apresenta como um homodímero estável em solução. Com base na superposiçãoestrutural, utilizando uma &beta;-frutofuranosidase de B. longum KN29.1, foi possível inferir os três aminoácidos essenciais envolvidos na transferência de unidades de frutosil pela BaFFase. Um ataque nucleofílico é realizado pelo grupo carboxílico do Asp131, formando um intermediário frutose-BaFFase; o Glu375 doa um próton, atuando como um catalisador ácido-base e o Asp269 estabiliza o estado transições na atividade de transferência frutose. Um novo domínio sanduíche-&beta; adicional para uma enzima GH32 é descrito. Esse domínio é responsável pelo aumento da região de contato e essencial para a formação do homodímero. Esta é a primeira estrutura cristalina da &beta;-frutofuranosidase do microrganismo B. adolescentis ATCC 15703, além de ser a primeira enzima GH32 descrita neste estado oligomérico pertencente ao reino das bactérias
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 24.08.2016
    • Acesso à fonte
    How to cite
    A citação é gerada automaticamente e pode não estar totalmente de acordo com as normas

    • ABNT

      MERA, Alain Eduard Monsalve. Structural and enzymatic features of a recombinant &beta;-fructofuranosidase from <i>Bifidobacterium adolescentis</i>. 2016. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Carlos, 2016. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-21102016-140952/. Acesso em: 24 jan. 2026.

    • APA

      Mera, A. E. M. (2016). Structural and enzymatic features of a recombinant &beta;-fructofuranosidase from <i>Bifidobacterium adolescentis</i> (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Carlos. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-21102016-140952/

    • NLM

      Mera AEM. Structural and enzymatic features of a recombinant &beta;-fructofuranosidase from <i>Bifidobacterium adolescentis</i> [Internet]. 2016 ;[citado 2026 jan. 24 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-21102016-140952/

    • Vancouver

      Mera AEM. Structural and enzymatic features of a recombinant &beta;-fructofuranosidase from <i>Bifidobacterium adolescentis</i> [Internet]. 2016 ;[citado 2026 jan. 24 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-21102016-140952/

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