Clonagem, expressão e imobilização de uma lipase de Beauveria bassiana com aplicação em biocatálise (2015)
- Authors:
- Autor USP: VICI, ANA CLAUDIA - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RBI
- Subjects: LIPASE; FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS; BIODIESEL
- Language: Português
- Abstract: Lipases (EC 3.1.1.3) são hidrolases que atuam na interface orgânico-aquosa, catalisando a hidrólise de ligações éster-carboxílicas de triacilgliceróis, liberando ácidos graxos e glicerol. Este grupo de enzimas possue algumas características importantes para diversos setores industriais, como a quimio- régio- e enantiosseletividade, assim como, a capacidade de promover reações de síntese, como a transesterificação, quando em ambiente aquo-restrito. Beauveria bassiana faz parte do grupo de fungos entomopatogênicos, pouco explorado no campo da biotecnologia. Esse fungo possui em seu genoma diversos genes com possível atividade de lipase. Neste contexto, o objetivo desse trabalho foi identificar uma lipase de B. bassiana, cloná-la e expressá-la em Komagataella (Pichia) pastoris, assim como purificar, caracterizar, imobilizar e averiguar o potencial de aplicação biotecnológica dessa enzima. Dentre os diversos genes codificadores de lipase de B. bassiana está o Beauveria bassiana Lipase A (Bbla), que possui 1641 pares de base e traduz uma proteína de 546 aminoácidos, incluindo um peptídeo sinal de 19 aminoácidos, com pI teórico de 5,4 e peso molecular de 60,94 kDa. Esse gene foi eficientemente expresso em K. pastoris, fusionado a uma cauda de 6 histidinas. A expressão da BbLA foi melhor em meio BMM, após 120 horas de indução com metanol 1%, a 30 °C e 200 rpm. A purificação foi realizada através de dois protocolos: (I) Cromatografia de afinidade a Cu2+ imobilizado, com fator de purificação de 17,82 e recuperação de 39,10 %; (II) Cromatografia de interação hidrofóbica em Octyl-Sepharose, com fator de purificação de 13,87 e recuperação de 75,58 %. A BbLA purificada sofreu ativação por surfactantes não iônicos e CTAB; Triton X-100 0,05% foi a condição de maior ativação. Nenhum dos sais de íons metálicos testados ativou a enzima. A temperatura e o pH ótimo de reaçãoforam avaliados em um planejamento composto central rotacional, que indicou um modelo reduzido com influência das duas variáveis. A melhor condição de atividade frente ao p-nitrofenil butirato (pNPB) foi 50 °C, pH 6,0. KM, Vmáx, kcat e Eficiência catalítica foram 0,5546 µM, 85,67 µmol.min-1.mg-1, 7,139 .104 s-1 e 1,29 .1011 M-1.s-1, respectivamente. A BbLA possui 35 % de seu peso molecular correspondente a N-glicosilações, tendo 78,57 kDa e 59,72 kDa nas suas formas glicosiladas e deglicosiladas, respectivamente. A modelagem molecular e o dicroísmo circular revelaram uma estrutura composta tanto por β-folhas como por α-hélices. A BbLA foi imobilizada por interação aniônica em DEAE-Sepharose, MANAE-Agarose e Duolite; e por interação hidrofóbica em Butyl-Toyopearl, Octyl-Sepharose, Sepabeads-C18, Lewatit 105 e Lewatit 1600. BbLA foi ativada em 52% por Octyl-Sepharose. O derivado mais estável a 40 °C foi o BbLA-Duolite, seguido do BbLA-Octyl, BbLA-Lew-105 e BbLA-C18. Esses derivados não atingiram a T50 após 5 horas de incubação. A 50 °C, os derivados mais estáveis foram BbLA-Duolite, BbLA-Octyl, e BbLA-C18, com T50 aproximada de 3 horas. Com exceção do BbLA-MANAE todos os derivados foram mais estáveis que o BbLA-BrCN-Seph. Os derivados de BbLA foram capazes de hidrolisar o óleo de sardinha com preferência por hidrolisar EPA. BbLA-C18 hidrolisou 3,9 e 3,3 vezes mais EPA que BbLA-Duolite e BbLA-Octyl. Para a produção de biodiesel, BbLA-C18 promoveu 7,35 e 13,61 vezes mais etanólise de EPA e DHA, respectivamente, do que BbLA-Duolite. Sobre a hidrólise da mistura racêmica de butirato mandélico, a maior conversão ocorreu com BbLA-Octyl que, assim como BbLA-C18, é mais seletiva para o isômero R, enquanto que BbLA-Duolite hidrolisou preferencialmente o isômero S. Esses resultados demonstram grande potencial de aplicação da enzima heteróloga BbLA em diferentes áreas da biotecnologia.
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2015
- Data da defesa: 13.02.2015
-
ABNT
VICI, Ana Claudia. Clonagem, expressão e imobilização de uma lipase de Beauveria bassiana com aplicação em biocatálise. 2015. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015. . Acesso em: 07 nov. 2024. -
APA
Vici, A. C. (2015). Clonagem, expressão e imobilização de uma lipase de Beauveria bassiana com aplicação em biocatálise (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. -
NLM
Vici AC. Clonagem, expressão e imobilização de uma lipase de Beauveria bassiana com aplicação em biocatálise. 2015 ;[citado 2024 nov. 07 ] -
Vancouver
Vici AC. Clonagem, expressão e imobilização de uma lipase de Beauveria bassiana com aplicação em biocatálise. 2015 ;[citado 2024 nov. 07 ] - Produção, purificação e imobilização de lipases produzidas por Beauveria brongniartii
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