Produção, purificação e imobilização de lipases produzidas por Beauveria brongniartii (2010)
- Authors:
- Autor USP: VICI, ANA CLAUDIA - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RBI
- Subjects: LIPASE; FUNGOS; BIOTECNOLOGIA; BIOQUÍMICA
- Language: Português
- Abstract: Lipases (EC 3.1.1.3) são um grupo de enzimas que atuam na interface orgânico-aquosa, catalisando a hidrólise de ligações éster-carboxílicas e liderando ácidos e álcoois orgânicos. Este trabalho objetivou a prospecção de fungos filamentosos produtores de lipases, o estudo da produção de lipases em fermentação submersa (FSm) e em estado sólido (FES) e a purificação, imobilização e caracterização dessas enzimas. Das amostras de solo e serragem coletadas no depósito de óleos da FFCLRP-USP, foram isolados 36 fungos, dos quais vários apresentaram potencial como produtores de lipases. Dos fungos analisados Beauveria brongniartii foi o que apresentou maior produção lipolitica, tanto intra como extracelular, quando incubado a 25° e 30°C. O melhor meio de cultivo em FSm para a produção de lipases foi o meio Khanna, adicionado de óleo de canola 1% (v/v), sob agitação (100rpm), por 72 horas. A adição de D-glucose 0,5% (m/v) a este meio aumentou a produção de lipase em 110%. Tanto extrato de levedura como peptona foram fontes de nitrogênio que incrementaram o crescimento e a produção de lipases do fungo. Estudos com delineamentos experimentais mostraram que a D-glucose e a peptona interferem negativamente na produção de lipases, sendo necessária a utilização de concentrações mais baixas desses componentes, de 0,25% e 0,05% (m/v), respectivamente. Além disso, óleo de canola interfere de modo positivo nessa produção, podendo-se utilizar concentrações de 3,5% (v/v) deste. A produção de lipases em FES foi máxima em meios com farelo de trigo umedecido com água deionizada, por 7 dias. A adição de óleo nim 10% (v/v) aumentou os níveis enzimáticos de lipase em 60%, em contraste ao observado com a adição de fontes extras de nitrogênio. Planejamento fatorial mostrou que o farelo de trigo interfe negativamente na produção de lipases, enquanto a água interfere de forma positiva, ficando padronizado para FES omeio contendo 4g de farelo de trigo, 9 mL de água e 0,4 mL de óleo nim. O extrato produzido por FES possui maior atividade lipolitica que o filtrado da FSm, entretanto este último possui atividade especifica muito maior que o outro, sendo mais interessante para estudos de purificação. Quanto à caracterização, as lipases intra e extracelulares produzidas por FSm e as produzidas por FES apresentam temperatura ótima de 60°, 70° e 60°C, respectivamente. As intra e extracelulares são termoestáveis até 70°C por 180 min, enquanto que as produzidas por FES são estáveis até 60°C por 180 min. O pH Étimo de atividade abrange uma faixa entre 4,5 e 6,5 para todos os extratos. As lipases intracelulares são estáveis em pHs de 2,5 a 7,5, as extracelulares de 5 a 7,5 e as de FES de 2,5 a 8,0. As lipases produzidas em FSm são mais estáveis a solventes orgânicos que aquelas produzidas por FES. O extrato produzido por FES apresentou maior atividade lipolítica contra substratos naturais do que o filtrado produzido por FSm, hidrolisando melhor o óleo de girassol e de oliva, enquanto que o filtrado de FSm hidrolisou melhor trioleina e óleo de soja. O filtrado da FSm foi parcialmente purificado por cromatografia em DEAE-Celulose e Octyl-Sepharose, isolando uma lipase de 46,85 kDa, com recuperação de 15,67% e fator de purificação de 5,12. Essa enzima possui pH e temperatura ótimo, determinados por planejamento fatorial, de 5,5 e 45°C, respectivamente. Essa enzima é termoestável a 70°C por 180 min e é parcialmente inibida por Co‘Cl IND. 2’, Na‘H IND. 2’P‘O IND. 4’ e HgCI. ‘K IND. M’ e ‘V IND. máx’ ficaram em torno de 2,05-3,2 ‘mü’mol e 185-227 U/mg de proteína, respectivamente. Um segundo tipo de lipase presente no filtrado foi purificado e imobilizado em um único passo em DEAE-Celulose. Essa lipase, com massa molecular estimada de 22,12 kDa, teve taxa de retenção no suporte de 51,04 e fator de purificação de 5,2.Essa enzima possui pH e temperatura ótimo, determinados por planejamento fatorial, de 5,5 e 55°C, respectivamente; é termoestável a 70°C por 240 min e foi mais termoestável a 75°C que na forma livre (‘T IND. 50’ de 15 min), com ‘T IND. 50’ de 25 min. A adição de glicerol 20% (v/v) aumentou a estabilidade da enzima imobilizada nessa temperatura, tendo ‘T IND. 50’ de 110 min. MG‘Cl IND. 2’, Zn‘(N‘O IND. 3’) IND. 2’, NaCl e HgCI inibiram parcialmente a atividade dessa enzima. ‘K IND. M’ e ‘V IND. máx’ ficaram em torno de 1,12-1,26 ‘mü’mol e 90 U/mg de proteína, respectivamente
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2010
- Data da defesa: 25.11.2010
-
ABNT
VICI, Ana Claudia. Produção, purificação e imobilização de lipases produzidas por Beauveria brongniartii. 2010. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2010. . Acesso em: 29 dez. 2025. -
APA
Vici, A. C. (2010). Produção, purificação e imobilização de lipases produzidas por Beauveria brongniartii (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. -
NLM
Vici AC. Produção, purificação e imobilização de lipases produzidas por Beauveria brongniartii. 2010 ;[citado 2025 dez. 29 ] -
Vancouver
Vici AC. Produção, purificação e imobilização de lipases produzidas por Beauveria brongniartii. 2010 ;[citado 2025 dez. 29 ] - Clonagem, expressão e imobilização de uma lipase de Beauveria bassiana com aplicação em biocatálise
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