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Tese

Avaliação do potencial biotecnológico de uma nova β-glicosidase do fungo Aspergillus fumigatus (2022)

  • Authors:
  • Autor USP: PEREIRA, LUCAS MATHEUS SOARES - FCFRP
  • Unidade: FCFRP
  • Sigla do Departamento: 602
  • DOI: 10.11606/D.60.2022.tde-25082023-102539
  • Subjects: GLICOSÍDEOS; EXPRESSÃO GÊNICA; ENZIMAS HIDROLÍTICAS; CLONAGEM; ASPERGILLUS
  • Keywords: β-glicosidase; β-glucosidase; Caracterização enzimática; Enzymatic characterization; Estimulação por glicose; Expressão heteróloga; Glucose stimulation; Heterologous expression; Sinergia; Synergy
  • Agências de fomento:
  • Language: Português
  • Abstract: A preocupação com impactos ambientais tem estimulado muitos esforços visando substituir os combustíveis fósseis por biocombustíveis, como o etanol. Porém, para tornar isso possível, é necessário investir em outras tecnologias de produção, como o etanol de segunda geração (2G), de modo a elevar os níveis desse produto e assim atender à crescente demanda. Atualmente, esse tipo de produção ainda não é viável economicamente, devido aos altos custos dos coquetéis enzimáticos utilizados na etapa de sacarificação das biomassas lignocelulósicas. De modo a otimizar esses coquetéis, a busca por enzimas com atividades superiores tem sido visada. As β-glicosidases, atuam na etapa final da sacarificação enzimática, catalisando a clivagem de ligações glicosídicas presentes na celobiose, liberando glicose e aumentando a eficiência das enzimas hidrolíticas que são inibidas pela celobiose no processo de hidrólise. Dessa forma, o projeto em questão realizou a clonagem, expressão em Pichia pastoris X-33, purificação e caracterização da enzima AfBgl1.3 de A. fumigatus. A avaliação estrutural da enzima recombinante, revelou a desestruturação da enzima devido ao aumento da temperatura. Na análise por dicroísmo circular (DC), foi possível observar a perda progressiva da estrutura α-hélice e aumento da estrutura folha-β antiparalela, e permitiu determinar o valor de Tm aparente de 48,5 °C. Em adição, foi possível predizer a proporção das estruturas secundárias α-hélice (36,3%) e folha-β (12,4%), a 25 °C. A análise por emissão intrínseca do triptofano permitiu determinar a exposição dos resíduos apolares no ambiente externo da proteína, obtendo-se o valor de Tm aparente de 49,3 °C. A caracterização bioquímica sugeriu as condições ótimas para sua atividade sendo de pH 6,0 e temperatura de 40 °C. Nas temperaturas de 30 °C e 40 °C, a enzimaapresenta-se estável, retendo cerca de 90 e 50% de atividade, respectivamente, após 24 horas de pré-incubação. A enzima também demonstrou alta estabilidade na faixa de pH 5-8, retendo mais que 65 % de sua atividade após 48 horas de pré-incubação. Como a inibição pelo produto é um dos desafios na utilização industrial de β-glicosidases, principalmente durante a degradação de celulose, avaliou-se a sua tolerância a glicose. A AfBgl1.3 recombinante foi estimulada em uma ampla faixa de concentração de glicose (1,8 - 90 g L-1), aumentando cerca de 1,4 vezes sua atividade, na presença de 45 g L-1 de glicose. A enzima ainda apresentou atividade sobre os substratos salicina (495,0 ± 49,0 U mg-1), pNPG (340,5 ± 18,6 U mg-1), celobiose (89,3 ± 5,1 U mg-1) e lactose (45,1 ± 0,5 U mg-1), podendo ser classificada como de ampla especificidade. Os valores de Vmax encontrados para a AfBgl1.3, foram de 656,0 ± 17,5 U mg-1, 706,5 ± 23,8 U mg-1 e 132,6 ± 7,1 U mg-1, para os substratos pNPG, Salicina e celobiose, respectivamente. A enzima atuou em sinergia com o coquetel enzimático comercial (Celluclast® 1.5L), uma vez que sua adição como suplemento, resultou em aumentos de cerca de 26% na taxa de conversão do substrato CMC em açúcares redutores (g L-1), após 12 horas de incubação na presença de 0,9 FPU/g de coquetel. Além disso a AfBgl1.3 também atuou em sinergia com as outras celulases do Aspergillus fumigatus já caracterizadas por nosso grupo de pesquisa sobre a degradação de CM-Celulose, o que resultou em maior liberação de açúcares redutores em relação ao controle. Os resultados obtidos podem ser importantes no contexto da busca por novas celulases e na otimização dos coquetéis enzimáticos utilizados durante a sacarificação
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 05.10.2022
    • Acesso à fonteAcesso à fonteDOI

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    Status:
    Artigo publicado em periódico de acesso aberto (Gold Open Access)
    Versão do Documento:
    Versão publicada (Published version)
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    • ABNT

      PEREIRA, Lucas Matheus Soares. Avaliação do potencial biotecnológico de uma nova β-glicosidase do fungo Aspergillus fumigatus. 2022. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2022. Disponível em: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60141/tde-25082023-102539/. Acesso em: 01 abr. 2026.

    • APA

      Pereira, L. M. S. (2022). Avaliação do potencial biotecnológico de uma nova β-glicosidase do fungo Aspergillus fumigatus (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de https://teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60141/tde-25082023-102539/

    • NLM

      Pereira LMS. Avaliação do potencial biotecnológico de uma nova β-glicosidase do fungo Aspergillus fumigatus [Internet]. 2022 ;[citado 2026 abr. 01 ] Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60141/tde-25082023-102539/

    • Vancouver

      Pereira LMS. Avaliação do potencial biotecnológico de uma nova β-glicosidase do fungo Aspergillus fumigatus [Internet]. 2022 ;[citado 2026 abr. 01 ] Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60141/tde-25082023-102539/

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