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Tese

Produção do Fator VIII recombinante em linhagem celular humana: caracterização do perfil de N-glicosilação e encapsulação em lipossomas (2019)

  • Authors:
  • Autor USP: FANTACINI, DAIANNE MACIELY CARVALHO - FMRP
  • Unidade: FMRP
  • Sigla do Departamento: RBP
  • Subjects: FATOR VIII; LIPOSSOMOS; LINHAGEM CELULAR
  • Agências de fomento:
  • Language: Português
  • Abstract: Hemofilia A é uma desordem sanguínea que resulta da deficiência ou perda de função do Fator VIII da coagulação (FVIII). O tratamento atual para a hemofilia A é a terapia de reposição com o FVIII recombinante (FVIIIr) ou FVIII derivado do plasma (FVIIIdp). A maior parte dos produtos FVIIIr disponível comercialmente é produzido em linhagens celulares não-humanas, as quais são incapazes de reproduzir certos padrões de glicosilação, ocasionando o aumento da imunogenicidade e farmacocinética alterada após administração em humanos. Além disso, o FVIII é uma glicoproteína de alto peso molecular e instável o que torna a sua produção muito desafiadora, sendo seu rendimento cerca de duas vezes menor que de outras proteínas. Esta instabilidade também se reflete no seu tempo de meia-vida relativamente curto (em torno de 12 horas), necessitando de infusões seriadas e pouco espaçadas para assegurar a correção do fenótipo. Portanto, a fim de estabelecer uma terapia profilática de longa-duração, muitos trabalhos têm tentado aumentar a meia-vida do FVIII na circulação, como por exemplo, através da PEGuilação do FVIII, fusão do FVIII com a porção Fc de imunoglobulinas ou associando o FVIII com lipossomas PEGuilados (PEGLip). No entanto, estas técnicas levaram a um aumento modesto na meia-vida do FVIII (1,5 a 2 vezes comparado com o FVIII não modificado). Neste estudo, nosso objetivo foi abordar várias limitações da produção do FVIII. Primeiramente, modificamos a célula humana Sk-hep para produzir FVIII (a partir daqui referida como FMVIIIr-Sk) e caracterizamos as modificações pós-traducionais das moléculas produzidas. Em seguida, nós estabelecemos uma nova estratégia de encapsulação do FVIIIr-Sk usando lipossomas biocompatíveis para prolongar o tempo de meia-vida do FVIIIr- Sk. A produção de FVIIl pela nossa célulahuamana modificada foi monitorada continuamente durante cinco meses. No primeiro mês, as células produziram aproximadamente 13,42+/-1,08 UI de FVIII/10⁶ células. Após quatro meses, a produção de FVIII se estabilizou em 5,17+/-0,8 UI de FVIII10⁶ células. Em sequência, um processo de purificação do FVIII foi desenvolvido com a seleção cuidadosa de resinas cromatográficas. Nós comparamos duas combinações diferentes de resinas: Sequência I (Capto MMC, VIIISelect, Hitrap SP e ultrafiltração) e Sequência II (VIIISelect, Hitrap SP e ultrafiltração). A Sequência II demonstrou melhor desempenho em purificar o FVIIIr-Sk. O processo de purificação resultou em um produto altamente puro (1,07 a razão de pureza), com um alto rendimento global de 40%. A atividade específica do produto final foi > 2400 UI/mg. As análises das modificações pós-traducionais revelaram que o FVIIIr-Sk possui principalmente estruturas neutras (63,81%), enquanto que glicanos mono e dissialilados estão presentes em menor proporção. Estes dados corroboram com nossas análises usando LC-MS/MS, as quais identificaram estruturas de alta-manose e estruturas complexas biantenárias com o core fucosilado (parcialmente ou completamente sialiado). Com o objetivo de estabelecer uma nova estratégia de encapsulação para o FVIIIr-Sk, nós desenvolvemos uma formulação lipossomal e a utilizamos para encapsular o FVIIIr-Sk. Os complexos lipossoma/FVIIIr-Sk demonstraram um potencial zeta de -19,7+/-3,67 mV, 152,6+/-0,42 nm de distribuição de tamanho, índice de polidispersão de 0,14+/-0,03 e eficiência de encapsulação de 56,05+/-3,23%. Subsequentemente, a estabilidade in vitro do FVIIIr-Sk foi testada em tampão fosfato e plasma deficiente de FVIII. Nossos dados demonstraram um decaimento de 97% da atividade biológica do FVIIIr-Sk após 7,5h em tampão fosfato. Notavelmente, o mesmo efeito ocorreu no FVIIIr-Sk encapsulado somente após 76h. No entanto, ambosnão-ensapsulado e encapsulado FVIIIr-Sk permaneceram estáveis em plasma deficiente de FVIII por pelo menos 76h. Em seguida, nós analisamos a eficácia terapêutica do FVIIIr-Sk encapsulado in vivo em um modelo de sangramento pela transecção da veia da cauda. Camundongos hemofílicos A receberam 13UI/Kg de FVIIIr-Sk encapsulado ou não-encapsulado, seguido da transecção da cauda após 24 horas. A sobrevida foi monitorada durante 13 dias. Todos os camundongos sobreviveram em ambos os grupos. Estes achados mostraram que ambos FVIIIr-Sk encapsulado e não-encapsulado são completamente funcionais e capazes de desencadear a cascata de coagulação. Para concluir, neste trabalho nós fomos capazes de gerar um FVIIIr produzido em linhagem celular humana Sk-hep e caracterizar seu perfil de glicosilação. Nós também demonstramos que nosso FVIIIr-Sk encapsulado teve meia-vida in vitro aumentada, estabelecendo assim a base para estudos adicionais destinados a avaliar se esta nova estratégia de encapsulação é também capaz de prolongar a meia-vida do FVIIIr in vivo
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 06.09.2019
    • How to cite
    A citação é gerada automaticamente e pode não estar totalmente de acordo com as normas

    • ABNT

      FANTACINI, Daianne Maciely Carvalho. Produção do Fator VIII recombinante em linhagem celular humana: caracterização do perfil de N-glicosilação e encapsulação em lipossomas. 2019. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2019. . Acesso em: 06 nov. 2024.

    • APA

      Fantacini, D. M. C. (2019). Produção do Fator VIII recombinante em linhagem celular humana: caracterização do perfil de N-glicosilação e encapsulação em lipossomas (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.

    • NLM

      Fantacini DMC. Produção do Fator VIII recombinante em linhagem celular humana: caracterização do perfil de N-glicosilação e encapsulação em lipossomas. 2019 ;[citado 2024 nov. 06 ]

    • Vancouver

      Fantacini DMC. Produção do Fator VIII recombinante em linhagem celular humana: caracterização do perfil de N-glicosilação e encapsulação em lipossomas. 2019 ;[citado 2024 nov. 06 ]

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