Produção do FVIII recombinante com mutações no domínio A1 e A2 visando o aumento da secreção em linhagem celular humana HEK293 (2015)
- Authors:
- Autor USP: FANTACINI, DAIANNE MACIELY CARVALHO - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RCM
- Subjects: HEMOFILIA; SECREÇÃO; MUTAÇÃO; ENZIMAS; COAGULAÇÃO SANGUÍNEA
- Language: Português
- Abstract: Hemofilia A é uma desordem sanguinea causada pela produção deficiente ou ausente de fator VIII (FVIII). Atualmente, a única terapia disponível é a terapia de reposição usando proteína derivada do plasma humano ou proteínas recombinantes produzidas em linhagem celular de roedores. No entanto, o fator VIII recombinante (FVIIIr) produzido em células de hamster não têm as modificações pós-traducionais idênticas àquelas do FVIII humano nativo, às quais podem levar a reações imunogênicas. Além disso, a expressão do FVIII nestes sistemas é ineficiente, porque o FVIIIr é retido dentro do retículo endoplasmático (RE) através de interações com várias proteínas chaperonas, incluindo a proteína ligante de imunoglobulina (BiP). O principal objetivo deste trabalho foi produzir um FVIII recombinante utilizando uma mutação pontual no domínio A1 (F309S) para aumentar a secreção somada a mutações no domínio A2 (R484A /R489A /P492A) para reduzir a imunogenicidade. Para a produção do FVIIIr foi utilizada uma linhagem celular humana HEK293 e como controle uma construção contendo o FVIIIΔB. As construções foram transferidas para as células humanas HEK293 através de repetidos ciclos de transdução com várias infecções de multiplicidade (MOI) para alcançar altos níveis de produção de FVIIIr. As moléculas de FVIIIr foram caracterizadas in vitro quanto à produção pelo ensaio cromogênico e o perfil de expressão gênica por PCR em tempo real. Nossos resultados mostraram que após cinco ciclos de transdução, a linhagem celular transduzida com a construção contendo as mutações (HEKMUT) foi capaz de produzir 7,5 UI/mL. Por outro lado, a linhagem celular transduzida com o controle (HEKΔB), a qual tem o mesmo número de cópia integrada do vetor, demonstrou atividade biológica igual a 2,5 UI/mL, ou seja, três vezes menos. Além disso, nós analisamos a expressão dos genesFVIII e BiP. Enquanto os níveis de expressão de FVIII foram mais altos nas células HEKMUT do que em HEKΔB, os níveis de RNAm de BiP não foram alterados em ambas as linhagens celulares, o mesmo foi constatado pelo Western Blot. Além da mutação F309S, testamos outra estratégia para melhorar a secreção. Nós partimos do princípio que a utilização de drogas químicas poderiam alterar a secreção do FVIII durante o cultivo celular. Para isto, nós testamos as drogas betaína e butirato de sódio nas linhagens modificadas. Surpreendentemente, somente a linhagem HEKΔB teve a produção de FVIII aumentada, ao passo que a linhagem HEKMUT não obteve nenhum efeito no tratamento com betaína, mas ocorreu uma diminuição de duas vezes na atividade do FVIII quando tratadas com butirato de sódio. Por fim, nós avaliamos o potencial hemostático da molécula pLFVIIIΔB que foi capaz de corrigir o sangramento provocado pela transecção total da cauda de camundongos hemofílicos A, enquanto que os animais do grupo controle morreram em até 50 horas após lesão. Estes dados destacam o papel da mutação F309S no aumento da secreção do FVIII em linhagem celular humana HEK293
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2015
- Data da defesa: 25.05.2015
-
ABNT
CARVALHO, Daianne Maciely Alves de. Produção do FVIII recombinante com mutações no domínio A1 e A2 visando o aumento da secreção em linhagem celular humana HEK293. 2015. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015. . Acesso em: 04 out. 2024. -
APA
Carvalho, D. M. A. de. (2015). Produção do FVIII recombinante com mutações no domínio A1 e A2 visando o aumento da secreção em linhagem celular humana HEK293 (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. -
NLM
Carvalho DMA de. Produção do FVIII recombinante com mutações no domínio A1 e A2 visando o aumento da secreção em linhagem celular humana HEK293. 2015 ;[citado 2024 out. 04 ] -
Vancouver
Carvalho DMA de. Produção do FVIII recombinante com mutações no domínio A1 e A2 visando o aumento da secreção em linhagem celular humana HEK293. 2015 ;[citado 2024 out. 04 ] - Produção do Fator VIII recombinante em linhagem celular humana: caracterização do perfil de N-glicosilação e encapsulação em lipossomas
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