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Tese

Estudo da glicosiltransferase LafB de <i>Enterococcus faecium</i> envolvida na supersensibilidade à daptomicina (2022)

  • Authors:
  • Autor USP: ESQUÉN, PAMELA IBETH HUANAMBAL - IFSC
  • Unidade: IFSC
  • Sigla do Departamento: FCI
  • DOI: 10.11606/D.76.2022.tde-18082022-093004
  • Subjects: TRANSFERASES; ENTEROCOCCUS; HIPERSENSIBILIDADE A DROGAS
  • Keywords: <i>Enterococcus faecium</i>; Daptomycin hypersusceptibility; Glicosiltransferase LafB; Glycosyltransferase LafB; Hipersensibilidade à daptomicina
  • Agências de fomento:
  • Language: Português
  • Abstract: Devido a crescente onda de resistência bacteriana a nível global, a Organização Mundial da Saúde classificou grupos de bactérias multidroga resistentes quanto à prioridade para a pesquisa e desenvolvimento de novos antibióticos, dentre os quais Enterococcus faecium resistentes à vancomicina (VRE) se encontra classificado como alta prioridade. Entre as opções terapêuticas de último recurso para combater infecções causadas por VRE está daptomicina (DAP), no entanto, a resistência a este antibiótico em VRE já foi relatada. Recentemente, pesquisadores do IFSC-USP detectaram que uma mutação no gene lafB de E. faecium causou hipersensibilidade a DAP. O gene lafB codifica a glicosiltransferase LafB, envolvida na via de formação da âncora do ácido lipoteicóico (LTA), que também está presente em outras bactérias gram-positivas como Listeria monocytogenes e Enterococcus faecalis. Deste modo, este trabalho procurou verificar o papel da mutação do gene lafB no fenótipo bacteriano, caracterizar biofisicamente a proteína, e estudar in-silico uma predição da estrutura tridimensional da LafB, pois é um alvo promissor para aumentar a atividade da DAP em bactérias gram-positivas. Para isso, foi feita uma comparação entre as linhagens de HBSJRP 18_2.1 (supersensível a DAP) e HBSJRP 18_2.7 (sensibilidade normal a DAP) acerca do crescimento bacteriano, perfil metabólico, capacidade de formação de biofilme e virulência in-vivo em modelo de Galleria mellonella. A mutação em lafB causou umasignificativa queda no crescimento bacteriano e virulência da linhagem supersensível, porém, não apresentou diferença significativa na capacidade de formação de biofilme, nem nas condições metabólicas analisadas. Concomitantemente, foi feita a clonagem, expressão e purificação por cromatografia de afinidade e de exclusão molecular da proteína LafB nativa e mutada. Ao contrário da LafB nativa, a proteína mutada é insolúvel nos passos de purificação nas mesmas condições de tampão e temperatura. Com amostras purificadas da proteína LafB nativa, se realizaram ensaios de dicroísmo circular e SEC-MALS. Sob condições in-vitro, LafB é monomérica, possui uma massa molecular de 41.76 kDa, temperatura de Melting de 37 °C, e possui estruturas secundárias -helicoidais. Para a análise in-silico, a estrutura tridimensional da proteína foi predita usando o software AlphaFold, adicionalmente, foi feito um acoplamento entre a estrutura predita da proteína e o ligante hipotético UDP-galactose. Os resultados sugerem que estruturalmente a LafB pertence às glicosiltransferases da família GTB, e que devido ao fato de a mutação estar próxima ao suposto sítio catalítico, é provável que as mudanças nas interações que ocorrem entre os aminoácidos da proteína e ligante, sejam a causa das mudanças observadas no fenótipo da linhagem mutada. No futuro, testes com diferentes condições de purificação serão feitos para estabilizar e cristalizar a proteína para resolver sua estrutura tridimensional, a fim deentender mais a fundo o papel da proteína LafB na sensibilidade a daptomicina
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 22.06.2022
    • Acesso à fonteAcesso à fonteDOI

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    Status:
    Artigo publicado em periódico de acesso aberto (Gold Open Access)
    Versão do Documento:
    Versão publicada (Published version)
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    • ABNT

      ESQUÉN, Pamela Ibeth Huanambal. Estudo da glicosiltransferase LafB de <i>Enterococcus faecium</i> envolvida na supersensibilidade à daptomicina. 2022. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Carlos, 2022. Disponível em: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76133/tde-18082022-093004/. Acesso em: 12 maio 2026.

    • APA

      Esquén, P. I. H. (2022). Estudo da glicosiltransferase LafB de <i>Enterococcus faecium</i> envolvida na supersensibilidade à daptomicina (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Carlos. Recuperado de https://teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76133/tde-18082022-093004/

    • NLM

      Esquén PIH. Estudo da glicosiltransferase LafB de <i>Enterococcus faecium</i> envolvida na supersensibilidade à daptomicina [Internet]. 2022 ;[citado 2026 maio 12 ] Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76133/tde-18082022-093004/

    • Vancouver

      Esquén PIH. Estudo da glicosiltransferase LafB de <i>Enterococcus faecium</i> envolvida na supersensibilidade à daptomicina [Internet]. 2022 ;[citado 2026 maio 12 ] Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76133/tde-18082022-093004/

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