Caracterização funcional de AP-1 e Arc/Arg3.1 no transporte e processamento de APP na via secretória tardia (2021)
- Authors:
- Autor USP: JANUÁRIO, YUNAN COSTA - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RBP
- Subjects: DOENÇA DE ALZHEIMER; PROTEÍNAS
- Keywords: Alzheimer; AP-1; APP; Arc/Arg3.1; Endosomes; Endossomos; Golgi; Secretory pathway; Via secretória
- Language: Português
- Abstract: A doença de Alzheimer é um tipo comum de demência causada por degeneração e morte neuronal. Uma das características histopatológicas desta doença é o acúmulo de peptídeos tóxicos β-amiloide (Aβ) no espaço extracelular, contribuindo para a formação das placas senis. O precursor direto de Aβ é o fragmento carboxi-terminal (CTFβ ou C99) da proteína precursora do beta-amiloide (APP). O C99 é detectado em níveis elevados no cérebro com Alzheimer e seu acúmulo intracelular foi relacionado à neurotoxicidade precoce, independentemente de Aβ. A clivagem proteolítica de APP em C99 ocorre durante seu transporte na via secretória. No entanto, as causas para o aumento dos níveis celulares de C99 são pouco compreendidas. Neste trabalho objetivou-se estudar a participação da proteína adaptadora 1 (AP-1) e de Arc/Arg3.1 no transporte e processamento de APP na via secretória tardia. Ensaios de imunoprecipitação e duplo híbrido mostraram que AP-1 interage com a APP e esta interação requer o domínio conservado 682YENPTY687 na cauda citosólica de APP e dois locais de ligação na subunidade µ1A de AP-1. Para entender a importância de AP-1 no transporte de APP utilizou-se ensaios de imunofluorescência e microscopia confocal realizados em células de linhagem humana (HeLa e H4) ou cultura primária de neurônios de rato. As análises foram realizadas empregando técnicas de silenciamento por RNAi, uso de células com gene deletado por CRISPR/Cas9 combinado com o resgate da expressão, expressão de dominante negativo e a expressão de um mutante de APP deficiente na interação com AP-1. A observação dos dados mostrou que AP-1 é essencial para transferir APP do complexo de Golgi para os endossomos. A interferência no transporte mediado por AP-1 leva a retenção de APP na rede trans-Golgi. Para analisar o processamento de APP e geração do fragmento C99 em célulasHeLa foi utilizado o ensaio de western blot com uso da ferramenta de transporte sincronizado na via secretória com Retention Using Selective Hooks (RUSH). O bloqueio no transporte de APP mediado por AP-1 reduz a cinética de geração de C99, mas leva ao aumento dos níveis intracelulares de C99 no estado de equilíbrio da distribuição subcelular de APP. Os resultados indicam que AP-1 controla diretamente a distribuição subcelular de APP de forma a regular a geração e o acúmulo intracelular do fragmento patogênico C99. Isso indica que os defeitos no transporte de APP/C99 mediado por AP-1 podem ser um fator potencial que contribui para o desenvolvimento da doença de Alzheimer. Em conjunto com estes resultados também foi estudado a participação da proteína Arc/Arg3.1 no transporte e processamento de APP. Arc é uma proteína que controla a plasticidade neuronal e cuja atividade foi anteriormente relacionada ao acúmulo de Aβ. Ensaios de western blot em células H4 mostraram que a expressão de Arc aumenta os níveis de APP e todos os seus fragmentos carboxi-terminais (CTFs), incluindo o fragmento C99. O uso de uma droga que inibe a atividade lisossomal mostrou que Arc favorece a geração do fragmento C99. Além disso, ensaios de imunofluorescência e microscopia confocal indicaram que Arc favorece o acúmulo de APP no sistema endossomal. Como tentativa de elucidar o possível mecanismo pelo qual Arc controla o transporte intracelular de APP na via secretória tardia foi analisado se Arc interage com as proteínas adaptadoras de vesículas (APs). Foi observado por ensaio de imunoprecipitação e ensaio de duplo híbrido que Arc interage eficientemente com a subunidade média µ de AP1, AP-2, AP-3 e AP-4. Estes dados mostram que Arc interfere no trânsito endolisossomal de APP levando ao aumento do fragmento C99 e que é capaz de interagir com diferentes APs, sendo esta a base de umpossível mecanismo pelo qual Arc regula o transporte de APP
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2021
- Data da defesa: 04.11.2021
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ABNT
JANUÁRIO, Yunan Costa. Caracterização funcional de AP-1 e Arc/Arg3.1 no transporte e processamento de APP na via secretória tardia. 2021. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2021. Disponível em: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-07022022-124115/. Acesso em: 23 abr. 2024. -
APA
Januário, Y. C. (2021). Caracterização funcional de AP-1 e Arc/Arg3.1 no transporte e processamento de APP na via secretória tardia (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-07022022-124115/ -
NLM
Januário YC. Caracterização funcional de AP-1 e Arc/Arg3.1 no transporte e processamento de APP na via secretória tardia [Internet]. 2021 ;[citado 2024 abr. 23 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-07022022-124115/ -
Vancouver
Januário YC. Caracterização funcional de AP-1 e Arc/Arg3.1 no transporte e processamento de APP na via secretória tardia [Internet]. 2021 ;[citado 2024 abr. 23 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-07022022-124115/
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