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Oxidação da proteína dissulfeto isomerase por peroxinitrito: cinética, produtos e implicações biológicas (2017)

  • Authors:
  • Autor USP: PEIXOTO, ÁLBERT SOUZA - IQ
  • Unidade: IQ
  • Sigla do Departamento: QBQ
  • Subjects: BIOQUÍMICA; OXIDAÇÃO; PROTEÍNAS; CINÉTICA
  • Language: Português
  • Abstract: Proteína dissulfeto isomerase (PDI) é uma ditiol-dissulfeto óxido redutase ubíqua que é responsável por uma série de funções celulares, inclusive na sinalização celular e nas respostas a eventos que causam dano celular. Entretanto, a PDI pode se tornar disfuncional através das modificações pós-traducionais, incluindo as promovidas por oxidantes biológicos. Estes oxidantes são provavelmente os responsáveis pelas modificações oxidativas pós-traducionais da PDI que foram detectadas em várias condições associadas ao estresse oxidativo, levando à disfunção da proteína. Devido a falta de estudos cinéticos com a PDI nativa e a falta de caracterização dos produtos dessas reações, investigamos se a diminuição da fluorescência da PDI nativa pode ser empregada para estudos da cinética de oxidação com peróxido de hidrogênio. Posteriormente, investigamos a cinética e os produtos da reação entre PDI e peroxinitrito. Nossos experimentos mostraram que a oxidação por excesso de peróxido de hidrogênio levava a uma diminuição da fluorescência de forma dependente do tempo e da concentração do oxidante, permitindo a determinação da constante de velocidade de segunda ordem (k = (17,3±1,3) ‘M POT.-1’ ‘s POT.-1’, pH 7,4, 25 ºC). Relevantemente, mostramos que o processo era totalmente revertido por DDT, mostrando que o peróxido de hidrogênio oxida quase que exclusivamente os grupos ditióis da PDI (‘Cys POT.53’ e ‘Cys POT.56’ e ‘Cys POT.397’ e ‘Cys POT.400’). Utilizando a mesma abordagem para estudar a oxidação da PDI por peroxinitrito, notamos que o decréscimo da fluorescência intrínseca da PDI nativa e a velocidade só era proporcional à concentrações sub-estequiométricas ou estequiométricas do oxidante em relação aos tióis reativos da PDI. Somente nessas condições o processo se mostrava reversível por DDT, indicando que os ditióis da PDIeram o alvo preferencial do peroxinitrito mas que a oxidação de outros resíduos também ocorria. A reação dos tióis reativos da PDI com peroxinitrito foi considerada relativamente rápida (6,9 ± 0,6 × ’10 POT.4’ ‘M POT.-1’ ‘s POT.-1’, pH 7,4, 25 °C), e os resíduos de Cys reativos dos domínios a e a' aparentam reagir com constantes de velocidade similares. Experimentos de proteólise limitada, simulações cinética e análises de MS e MS/MS confirmaram que o peroxinitrito oxida preferencialmente os tióis redox ativos da PDI para os ácidos sulfênicos correspondentes, que, subsequentemente, reagem com os tióis vizinhos, produzindo dissulfetos (‘Cys POT.53’- ‘Cys POT.56’ e ‘Cys POT.397’- ‘Cys POT.400’). Entretanto, uma fração de peroxinitrito decai para radicais levando à hidroxilação e nitração de outros resíduos próximos ao sítio redox ativo (‘Trp POT.52’ ‘Trp POT.396’ e ‘Tyr POT.393’). Assim, investigamos também a oxidação da PDI por excesso de peroxinitrito em relação aos grupos tióis reativos por diferentes metodologias. Experimentos de SDS-PAGE, western-blot e atividade redutase mostraram que o peroxinitrito promove inativação, nitração e agregação da PDI de forma dependente da concentração de peroxinitrito. Análises de MS e MS/MS mostraram que, em excesso, o peroxinitrito promove nitração (‘Tyr POT.43’, ‘Tyr POT.49’, ‘Tyr POT.196’, ‘Tyr POT.393’, ‘Trp POT.52’, ‘Trp POT.396’) e hidroxilação (‘Trp POT.52’, ‘Trp POT.396’) da PDI. Em síntese, nossos estudos contribuem para melhor compreensão da oxidação da PDI por peroxinitrito e de suas possíveis consequências biológicas.
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 27.10.2017
  • Acesso à fonte
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    • ABNT

      PEIXOTO, Álbert Souza; AUGUSTO, Ohara. Oxidação da proteína dissulfeto isomerase por peroxinitrito: cinética, produtos e implicações biológicas. 2017.Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-14122017-142837/ >.
    • APA

      Peixoto, Á. S., & Augusto, O. (2017). Oxidação da proteína dissulfeto isomerase por peroxinitrito: cinética, produtos e implicações biológicas. Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-14122017-142837/
    • NLM

      Peixoto ÁS, Augusto O. Oxidação da proteína dissulfeto isomerase por peroxinitrito: cinética, produtos e implicações biológicas [Internet]. 2017 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-14122017-142837/
    • Vancouver

      Peixoto ÁS, Augusto O. Oxidação da proteína dissulfeto isomerase por peroxinitrito: cinética, produtos e implicações biológicas [Internet]. 2017 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-14122017-142837/


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