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Edição gênica de Aire em células mTEC induzida por CRISPR-Cas9 evidencia seu papel modulador da expressão gênica durante a adesão com timócitos (2017)

  • Authors:
  • Autor USP: HERNANDEZ, CESAR AUGUSTO SPECK - FMRP
  • Unidade: FMRP
  • Sigla do Departamento: RBI
  • Subjects: EXPRESSÃO GÊNICA; TIMO (SISTEMAS SANGUÍNEO E IMUNE); TECIDO LINFOIDE
  • Language: Português
  • Abstract: O timo é um órgão linfóide primário constituído de uma complexa e densa rede de timócitos e células tímicas epiteliais (mTECs e cTECs). A função das mTECs é a expressão ectópica de antígenos de tecidos periféricos (PTAs) regulada, em grande parte, pelo gene Autoimmune Regulator (Aire). As mTECs deficientes de Aire apresentam redução na expressão de PTAs enquanto que camundongos knockout (KO) Aire-/- desenvolvem autoimunidade. O alvo desse estudo foi gerar células mTECs Aire KO e avaliar as implicações na expressão de PTAs e de genes envolvidos no processo de adesão mTECs-timócitos. Para gerar células mTEC Aire KO, nós utilizamos o sistema CRISPR-Cas9-GFP especifico para o éxon 3 de Aire para transfectar a linhagem mTEC 3.10 in vitro. Conseguimos clones de mTECs apresentando mutações do tipo indels no éxon 3 desse gene acarretando a tradução de uma proteína AIRE truncada. Analises de mRNA (qRT-PR) e proteína (imunofluorescência) demonstraram a alteração da expressão de Aire em célula mTECs KO. Por outro lado, para avaliar as implicações de Aire sobre a adesão rnTECs-timócitos, células mTEC Aire KO e CT (controle) foram cultivadas em co-cultura com timócitos. Os resultados evidenciam que células mTEC Aire KO apresentam habilidade reduzida de adesão com timócitos. Análises por citometria de fluxo mostraram que a expressão das moléculas de superficie CD80 e MHC-II, também estavam reduzidas nas células Aire KO. A análise do transcriptoma, via sequenciamento por RNA-seq, de células mTEC KO e CT tanto antes como depois da adesão com timócitos mostrou que a deficiência de Aire gera alteração na expressão de mRNAs que codificam moléculas de adesão. Por outro lado, a adesão mTECs-timócitos acarretou um aumento da expressão de Aire pelas mTECs não manipuladas além de outros fatores de transcrição como Tcf7 emembros da via NF-kB. Nossos resultados revelaram um papel importante do gene Aire na adesão entre células mTEC com timócitos, processo crucial para a tolerância imunológico central e a prevenção de doenças autoimunes
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 22.02.2017

  • How to cite
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    • ABNT

      HERNANDEZ, Cesar Augusto Speck; PASSOS JUNIOR, Geraldo Aleixo da Silva; RICCARDI, Amanda Freire de Assis. Edição gênica de Aire em células mTEC induzida por CRISPR-Cas9 evidencia seu papel modulador da expressão gênica durante a adesão com timócitos. 2017.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017.
    • APA

      Hernandez, C. A. S., Passos Junior, G. A. da S., & Riccardi, A. F. de A. (2017). Edição gênica de Aire em células mTEC induzida por CRISPR-Cas9 evidencia seu papel modulador da expressão gênica durante a adesão com timócitos. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
    • NLM

      Hernandez CAS, Passos Junior GA da S, Riccardi AF de A. Edição gênica de Aire em células mTEC induzida por CRISPR-Cas9 evidencia seu papel modulador da expressão gênica durante a adesão com timócitos. 2017 ;
    • Vancouver

      Hernandez CAS, Passos Junior GA da S, Riccardi AF de A. Edição gênica de Aire em células mTEC induzida por CRISPR-Cas9 evidencia seu papel modulador da expressão gênica durante a adesão com timócitos. 2017 ;


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