Produção, purificação, caracterização e expressão heteróloga de L-lisina α-oxidase de Trichoderma harzianum e avaliação de seu pontencial antitumoral (2015)
- Authors:
- Autor USP: COSTA, MARIANA DO NASCIMENTO - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RBI
- Subjects: ENZIMAS OXIRREDUTORAS; TRICHODERMA; EXPRESSÃO GÊNICA; ANTINEOPLÁSICOS
- Language: Português
- Abstract: As L-aminoácido oxidases (LAAOs) são enzimas que podem ser encontradas em diferentes organismos e são alvo de grande interesse médico devido a sua alta citotoxicidade sobre diversos patógenos e linhagens de células tumorais. A L-lisina α-oxidase (LO) de Trichoderma harzianum é uma flavoenzima que catalisa a reação de desaminação da L-lisina, exibindo efeito citotóxico elevado em diversas linhagens tumorais. A produção de proteínas recombinantes é uma ferramenta muito importante na busca por novas enzimas que afetem reações metabólicas essenciais para o crescimento celular tumoral. Sendo assim, esse trabalho propõe a produção heteróloga de LO de T. harzianum e a avaliação de seu potencial antitumoral. Inicialmente, a enzima LO nativa foi purificada e analisada por espectrometria de massas. A partir da sequência genômica determinada, foi feita a clonagem e expressão heteróloga em E. coli, sendo a proteína recombinante (rLO) expressa na forma solúvel e com bom rendimento. Um estudo de caracterização bioquímica e cinética foi realizado comparando a enzima nativa e recombinante. A rLO apresentou pH ótimo 4 e temperatura ótima em 25oC, enquanto que LO nativa apresentou pH ótimo 8 e temperatura ótima em 45oC. Com relação os parâmetros cinéticos, rLO obteve valores de KM e Vmáx maiores do que a nativa e o número de Hill calculado para ambas mostrou que rLO se trata de uma enzima Michaeliana e LO de uma enzima Cooperativa. Esses dados são evidências de que pode se tratar de duas isoformas diferentes da mesma enzima, sendo que essa divergência pode ocorrer devido a modificações pós traducionais na proteína nativa. Posteriormente, avaliou-se o potencial citotóxico da rLO frente às linhagens tumorais leucêmicas K562 e Jurkat. A análise por citometria de fluxo mostrou que rLO diminui a viabilidade de PBMC em doses maiores que 200 µU/mL. Através do ensaio PDL, verificou-seque o tratamento aplicado foi capaz de inibir o crescimento das células tumorais. Observou-se que em ambas as linhagens tumorais o tratamento com 10 mU/mL de rLO inviabilizou as células após 48 horas, apresentando um comportamento mais agressivo do que o promovido por ATO. Com relação à linhagem K562, as concentrações maiores que 0,5 mU/mL de rLO foram as que promoveram uma maior redução no crescimento celular quando comparado a células sem tratamento. A linhagem K562 é mais sensível ao tratamento com rLO do que a Jurkat, cujo crescimento foi influenciado por doses maiores que 2 mU/mL. Conclui-se que a rLO é capaz de reduzir a viabilidade e inibir o crescimento de células tumorais leucêmicas, sendo, portanto, um importante alvo de estudo na terapia anti-câncer
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2015
- Data da defesa: 14.09.2015
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ABNT
COSTA, Mariana do Nascimento. Produção, purificação, caracterização e expressão heteróloga de L-lisina α-oxidase de Trichoderma harzianum e avaliação de seu pontencial antitumoral. 2015. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015. . Acesso em: 29 dez. 2025. -
APA
Costa, M. do N. (2015). Produção, purificação, caracterização e expressão heteróloga de L-lisina α-oxidase de Trichoderma harzianum e avaliação de seu pontencial antitumoral (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. -
NLM
Costa M do N. Produção, purificação, caracterização e expressão heteróloga de L-lisina α-oxidase de Trichoderma harzianum e avaliação de seu pontencial antitumoral. 2015 ;[citado 2025 dez. 29 ] -
Vancouver
Costa M do N. Produção, purificação, caracterização e expressão heteróloga de L-lisina α-oxidase de Trichoderma harzianum e avaliação de seu pontencial antitumoral. 2015 ;[citado 2025 dez. 29 ]
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