Clonagem e expressão de fator IX recombinante em células 293T e SK-Hep-1 e caracterização das células produtoras (2013)
- Authors:
- Autor USP: BOMFIM, ALINE DE SOUSA - FCFRP
- Unidade: FCFRP
- Sigla do Departamento: 602
- Subjects: HEMOFILIA; BIOMARCADORES; LINHAGEM CELULAR
- Keywords: Fator IX recombinante; Hemofilia B; Hemophilia B; Human cell lines; Lentiviral vectors; Linhagens celulares humanas; Recombinant factor IX; Vetores lentivirais
- Agências de fomento:
- Language: Português
- Abstract: O fator IX (FIX) da coagulação sanguínea é uma proteína dependente de vitamina K de grande valor farmacêutico no tratamento da Hemofilia B, o qual é baseado na administração do fator de coagulação derivado de plasma humano ou da proteína recombinante produzida em células murinas. A terapia baseada nestas abordagens apresenta alto custo e está associada às contaminações com vírus e príons, além do desenvolvimento de inibidores de FIX. Esses efeitos aumentam o risco de morbidade e mortalidade relacionadas às hemorragias. Neste trabalho, clonamos o cDNA do FIX em um vetor lentiviral e avaliamos a expressão da proteína recombinante em duas linhagens celulares humanas. A clonagem do cDNA do FIXh no vetor de expressão lentiviral 1054 foi confirmada através da análise com enzimas de restrição específicas obtendo-se as bandas esperadas de 1407 pb e 10054 pb visualizadas em gel de agarose. As linhagens celulares 293T e SK-Hep-1 foram transduzidas com o vetor lentiviral 1054-FIX gerado em nosso laboratório e as células que apresentaram maior expressão de EGFP foram selecionadas e separadas por citometria de fluxo. A quantificação da expressão de FIXrh foi realizada por ensaios de ELISA e cromogênico. A quantificação de FIXrh total foi de 500 ng/106 células para a linhagem 293T e 803 ng/106 células para a linhagem SK-Hep-1. A atividade biológica específica de FIXh nas células 293T e SK-Hep-1 foi 0,047 UI/106 células e 0,186 UI/106 células, respectivamente. Com o intuito de avaliar o perfil de produção de FIXrh ativo ao longo do tempo, foi realizado um acompanhamento de 180 dias, no qual foi observado que a linhagem SK-Hep-1 cessou a expressão de FIX, enquanto as células 293T mantiveram a expressão durante o período. O FIXrh foi caracterizado por western blot confirmando a presença de uma banda imunoreativa esperada de 57 kDa. As linhagens 293T e SK-Hep-1 apresentaram 7,67 e 17 cópiasdo vetor inserido/célula, respectivamente. Considerando a importância do processo de ?-carboxilação, foi realizada uma análise da expressão gênica dos genes envolvidos neste processo, tais como o VKORC1, ?-carboxilase e o inibidor calumenina, nas linhagens celulares. Os resultados demonstraram razões elevadas entre os genes VKORC1 e calumenina e VKORC1 e ?-carboxilase nas duas linhagens. A cinética de crescimento das células foi realizada por um período de 7 dias apresentando diferenças significativas entre as células SK-Hep-1 transduzidas e não transduzidas, enquanto que as células 293T não presentaram diferenças estatísticas no crescimento celular. A suplementação do meio de cultura com íons Ca+2 e Mg+2 foi testada para avaliar sua influência na expressão de FIXrh ativo. As células 293T apresentaram melhor desempenho nas concentrações de 0,5 mmol/L de Ca+2 e 1,0 mmol/L de Mg+2 e as células SK-Hep-1 no meio de cultura não suplementado. Nossos dados indicam que a linhagem hepática SK-Hep-1 é a melhor produtora de FIXrh funcional e as comparações realizadas entre os dois tipos celulares são importantes na caracterização do comportamento de linhagens geneticamente modificadas voltadas para a expressão de proteínas recombinantes heterólogas e abre novos caminhos para futuros estudos que visam o melhoramento da produção desse tipo de proteína
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2013
- Data da defesa: 27.09.2013
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ABNT
BOMFIM, Aline de Sousa. Clonagem e expressão de fator IX recombinante em células 293T e SK-Hep-1 e caracterização das células produtoras. 2013. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-13122013-111826/. Acesso em: 14 out. 2024. -
APA
Bomfim, A. de S. (2013). Clonagem e expressão de fator IX recombinante em células 293T e SK-Hep-1 e caracterização das células produtoras (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-13122013-111826/ -
NLM
Bomfim A de S. Clonagem e expressão de fator IX recombinante em células 293T e SK-Hep-1 e caracterização das células produtoras [Internet]. 2013 ;[citado 2024 out. 14 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-13122013-111826/ -
Vancouver
Bomfim A de S. Clonagem e expressão de fator IX recombinante em células 293T e SK-Hep-1 e caracterização das células produtoras [Internet]. 2013 ;[citado 2024 out. 14 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-13122013-111826/
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