Avaliação funcional da proteína anônima relacionada à trombospondina 2 de Neospora caninum (NcMIC2-like1) (2013)
- Authors:
- Autor USP: PEREIRA, LUIZ MIGUEL - FCFRP
- Unidade: FCFRP
- Sigla do Departamento: S/D
- Subjects: NEOSPORA CANINUM; GENÉTICA (MANIPULAÇÃO)
- Keywords: Controle de expressão; Expression control; Micromene; Micronemas; NcMic2-like1; NcMic2-like1; Neospora caninum; Transfecção; Transfeccion
- Language: Português
- Abstract: Neospora caninum é um protozoário Apicomplexa, parasita intracelular obrigatório que possui o cão e outros canídeos como hospedeiros definitivos e os bovinos como principais hospedeiros intermediários. Causa nos primeiros encefalopatia e nos últimos abortos com perda da fertilidade, gerando prejuízos significativos na pecuária mundial. Como Toxoplasma gondii e Plasmodium, N. caninum possui um sistema específico de secreção que permite a invasão ativa do parasita na célula hospedeira, formação do vacúolo parasitóforo e replicação. Devido ao seu ciclo intracelular, várias estratégias foram desenvolvidas para caracterizar o processo de invasão no filo, como deleção ou controle da expressão de genes envolvidos. Entre os genes com papel importante no processo invasivo, NcMic2-like1 possui destaque já que o soro contra essa proteína recombinante inibiu 60% da invasão de N. caninum in-vitro. Essa proteína micronêmica possui domínios adesivos (uma integrina e seis trombospondinas) que atuam na ligação entre os receptores da célula hospedeira e o motor de actina e miosina do parasita, possibilitando a invasão ativa. O objetivo central do trabalho foi o desenvolvimento de ferramentas genéticas para a deleção e hiperexpressão de NcMic2-like1 e outras proteínas em N. caninum para a compreensão profunda desse mecanismo, além da caracterização, localização e expressão de NcMic2-like1. Para isso dois modelos baseados na resistência a drogas e integração ao genoma do parasita foram construídos. Um se baseia na resistência contra cloranfenicol (pelo gene Cloranfenicol Acetil Transferase - CAT) e o outro contra pirimetamina (pela mutação da Diidrofolato Redutase-Timidilato Sintase - DHFRM2M3). As sequências que conferem resistência foram ligadas ao promotor e região 3\' UTR de três genes de N. caninum, NcSAG1 (ou SAG1-like); NcDHFR ou NcHXGPRT conferindo resistência às drogas após transfecção.A esses vetores de resistência foram ligadas duas sequências do controle de expressão por tetraciclina, o sistema TetR/tetO. Adaptando o sistema de T. gondii para N. caninum, TetR foi expresso sob controle do promotor RPS13 ou Tubulina de N. caninum e tetO controlou a expressão de Lac-Z (?-galactosidase), ii uma enzima repórter. TetR e tetO foram transfectados de modo estável utilizando os vetores CAT e DHFRM2M3. O sistema foi responsivo à adição de tetraciclina, além de indicar um meio provavelmente independente de TetR quando apenas tetO foi avaliado em N. caninum. Foi possível expressar Lac-Z em N. caninum, possibilitando o desenvolvimento e padronização de ensaios de invasão, crescimento e detecção do taquizoíta. Também foi realizada a detecção de YFP (proteína amarelo fluorescente) nos taquizoítas transfectados com YFP fundida em TetR. Essas ferramentas de inserção e deleção de genes possibilitaram a construção de vetores para a hiper expressão ou deleção de NcMic2-like1. Para hiper expressão o vetor foi obtido pela substituição de Lac-Z pelo gene NcMic2-like1. Para deleção de NcMic2-like1 o vetor foi desenvolvido pela ligação do seu promotor e região 3\' UTR ä CAT ou NcDHFRM2M3, que promove a substituição do gene alvo pelos de resistência por recombinação homóloga. Adicionalmente foram desenvolvidas formas para a expressão e purificação de proteínas em N. caninum. Também foi obtida a solubilização de NcMIC2-like1 recombinante pelo sistema pET28 após a adição de uma cauda solúvel amplificada do genoma de N. caninum. O desenvolvimento de métodos de manipulação genética é um fato inédito para N. caninum e possibilitará estudos moleculares mais profundos sobre os mecanismos de invasão e replicação, onde NcMic2-like1 aparece como primeira candidata para esses ensaios
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2013
- Data da defesa: 30.08.2013
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ABNT
PEREIRA, Luiz Miguel. Avaliação funcional da proteína anônima relacionada à trombospondina 2 de Neospora caninum (NcMIC2-like1). 2013. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-29102013-145501/. Acesso em: 29 dez. 2025. -
APA
Pereira, L. M. (2013). Avaliação funcional da proteína anônima relacionada à trombospondina 2 de Neospora caninum (NcMIC2-like1) (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-29102013-145501/ -
NLM
Pereira LM. Avaliação funcional da proteína anônima relacionada à trombospondina 2 de Neospora caninum (NcMIC2-like1) [Internet]. 2013 ;[citado 2025 dez. 29 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-29102013-145501/ -
Vancouver
Pereira LM. Avaliação funcional da proteína anônima relacionada à trombospondina 2 de Neospora caninum (NcMIC2-like1) [Internet]. 2013 ;[citado 2025 dez. 29 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-29102013-145501/ - Caracterização da proteína anônima relacionada à trombospondina 2 (TRAP 2) do protozoário Neospora caninum no processo de invasão celular
- The soluble fraction of Neospora caninum treated with PI-PLC is dominated by NcSRS29B and NcSRS29C
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