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(Na+,K+)-ATPase branquial e a osmorregulação em crustáceos: efeito da salinidade na expressão e características cinéticas da wnzima de Callinectes ornatus Ordway, 1863 (Crustacea, Portunidae) (2010)

  • Authors:
  • Autor USP: GARÇON, DANIELA PEREIRA - FFCLRP
  • Unidade: FFCLRP
  • Sigla do Departamento: 593
  • Subjects: CRUSTACEA; CARANGUEJO; ENZIMOLOGIA
  • Language: Português
  • Abstract: A (‘Na POT. +’, ‘K POT. +’)-ATPase presente no tecido branquial dos crustáceos osmorreguladores é um componente essencial do sistema de regulação iônica e osmótica desses animais, apresentando também um papel relevante no processo de excreção ativa de ‘NH IND.4’’POT. +’ através do tecido branquial dos crustáceos. Uma fração microsomal rica em (‘Na POT. +’, ‘K POT. +’)-ATPase foi preparada por centrifugação diferencial a partir de um homogeneizado do tecido branquial de Callinectes ornatus aclimatado a salinidades de 21 e ’33 partes por mil’. A redistribuirão da (‘Na POT. +’, ‘K POT. +’)-ATPase em frações de membrana de diferentes densidades, sugere que a aclimatação a diferentes salinidades altera a composição da membrana. A eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes revela que houve uma variação no perfil protéico durante a aclimatação. A presença de uma única banda imunorreativa (Mr~ 109 kDa) detectada na análise por Western blot sugere a presença de uma única isoforma da subunidade ‘alfa’ da (‘Na POT. +’, ‘K POT. +’)-ATPase. A proporção relativa desta subunidade nos microsomas de animais aclimatados a ’21 partes por mil’ é cerca de 2,5 vezes maior que a observada a ’33 partes por mil’. A atividade ‘K POT. +’-fosfatase da (‘Na POT. +’,’K POT. +’)-ATPase branquial de C. ornatus aclimatado à salinidade ’21 partes por mil’ é aproximadamente 2,5 vezes maior comparada ao animais aclimatados a ’33 partes por mil’. A (‘Na POT. +’, ‘K POT. +’)-ATPase de C. ornatus aclimatado a ’21 partes por mil’ hidrolisou o PNPP ( V= 69,2 ‘+ OU -‘ 2,8 U ‘mg POT. -1’ e ‘K IND. 0,5’= 2,3’+OU-‘ 0,1 mmol ‘L POT. -1’) através de interações sítio-sítio (‘n IND. H’= 1,7). A modulação da enzima pelos tons magnésio(V= 70,1’+ OU -‘ 3,0 U ‘mg POT. -1’ e ‘K IND 0,5’ = 0,88 ‘+ OU -‘ 0,04 mmol ‘L POT. -1’, potássio (V= 69,6’+ OU -‘ 2,7 U ‘mg POT. -1’ e ‘K IND.0,5’= 1,6 ‘+ OU -‘ 0,07 mmol ‘L POT. -1’) e amônio (V= 90,8’+ OU -‘ 4,0 U ‘mg POT. -1’ e ‘K IND 0,5’ = 9,2’+ OU -‘ 0,3 mmol ‘L POT. -1’) ocorreu através de interações sítio-sítio. Os íons sódio atuaram como inibidores da atividade ‘K POT. +’fosfatase da enzima (Ki= 9,2’+ OU -‘ 0,4 mmol ‘L POT. -1’) e a ouabaína inibiu cerca de 70% da atividade PNPPase, independentemente da presença de íons amônio. A atividade ‘K POT. +’-fosfatase da (‘Na POT. +’’K POT. +’)-ATPase de C. ornatus aclimatado a ’33 partes por mil’. é estimulada pelo PNPP de acordo com uma única curva de saturação monofásica envolvendo interações sítio-sítio (‘n IND. H’ = 1,4), com V= 29,1 ‘+ OU -‘ 1,4 U ‘mg POT. -1’ e ‘K IND.0,5’= 1,30 ‘+ OU -‘ 0,06 mmol ‘L POT. -1’. Os íons magnésio estimularam a atividade até um valor máximo de V= 27,8 ‘+ OU -‘ 1,3 U ‘mg POT. -1’ com ‘K IND.0,5’= 1,00 ‘+ OU -‘ 0,04 mmol ‘L POT. -1’ tendo sido observadas interações sítio-sítio (‘n IND. H’ = 1,7). A estimulação pelo ‘K POT. +’ ocorreu com cooperatividade positiva (‘n IND. H’= 1,9), V= 28,0 ‘+ OU -‘ 1,4 U ‘mg POT. -1’ e ^’K IND.0,5’ = 2,4 ‘+ OU -‘ 0,1 mmol ‘L POT. -1’. Uma única curva de estimulação também foi observada para ‘NH IND.4’’POT. +’, com V= 32,2 ‘+ OU -‘ 1,5 U ‘mg POT. -1’, ‘K IND.0,5’= 1,2 ‘+ OU -‘ 0,4 mmol ‘L POT. -1’ e ‘n IND.H’ = 2,2. Os íons sódio atuaram como inibidores da atividade ‘K POT. +’-fosfatase da enzima (Ki= 4,7 ‘+ OU -‘ 0,2 mmol ‘L POT. -1’) e a ouabaína inibiu cerca de 80% a atividade PNPPase independentes da presença de íons amônio.A atividade ‘K POT. +’-fosfatase da (‘Na POT. +’,’K POT. +’)-ATPase foi estimulada sinergisticamente pelos íons potássio e amônio, tanto para C. ornatus aclimatado a ’21 partes por mil’ como a ’33 partes por mil’. A (‘Na POT. +’, ‘K POT. +’)-ATPase presente na fração microsomal de C. ornatus aclimatado a ’21 partes por mil’, hidrolisou o ATP de acordo com cinética de Michaeliana apresentando ‘K IND. M’ = 50,0 ‘+ OU -‘ 2.5 ‘mü’mol ‘L POT. -1’ e V= 187,7 ‘+ OU -‘ 7.1 U ‘mg POT. -1’. A modulação da atividade da enzima pelos íons magnésio (V= 183,5 ‘+ OU -‘ 6,7 U ‘mg POT. -1’ e ‘K IND.0,5’= 0,27 ‘+ OU -‘ 0,01 mmol ‘L POT. -1’), sódio (V= 175,9 ‘+ OU -‘ 6,3 U ‘mg POT. -1’ e ‘K IND.0,5’= 4,2 ‘+ OU -‘ 0,2 mmol ‘L POT. -1’), potássio (V= 181,8 ‘+ OU -‘ 6,9 U ‘mg POT. -1’ e ‘K IND.0,5’= 1,0 ‘+ OU -‘ 0,05 mmol ‘L POT. -1’) e amônio (V= 240,7 ‘+ OU -‘ 11,2 U ‘mg POT. -1’ e ‘K IND.0,5’= 4,4 ‘+ OU -‘ 0,2 mmol ‘L POT. -1’) ocorreram através de interações sítio-sítio. Também foi observado que, na presença de concentrações crescentes de íons amônio, a estimulação da atividade (‘Na POT. +’,’K POT. +’)-ATPase pelos íons potássio acarretou um aumento de 32% na atividade específica da enzima. A ouabaína inibiu cerca de 88% da atividade ATPase com ‘K IND. l’ = 74,5 ‘+ OU -‘ 0,22 ‘mü’M, sugerindo a presença de 12% de outras ATPase, sendo 5% de ATPase do tipo F, 3% de ‘K POT. +’-ATPase e 3% de V-ATPase. Para C. ornatus aclimatado a ’33 parte por mil’ a (‘Na POT. +’,’K POT. +’)-ATPase branquial hidrolisou o ATP obedecendo cinética Michaeliana, com V = 76,2 ‘+ OU -‘ 3,5 U ‘mg POT. -1’ e ‘K IND. M’ = 46,0 ‘+ OU -‘ 1,9 , ‘mü’mol ‘L POT. -1’. A estimulação da atividade(‘Na POT. +’,’K POT. +’)-ATPase por ‘mg POT.2+’ (V=74,5 ‘+ OU -‘ 3,1 U ‘mg POT. -1’; ‘K IND.0,5’= 0,33 ‘+ OU -‘ 0,16 mmol ‘L POT. -1’), ‘K POT. +’ (V=76,4 ‘+ OU -‘ 3,3 U ‘mg POT. -1’; ‘K IND.0,5’ = 1,03 ‘+ OU -‘ 0,05 mmol ‘L POT. -1’), ‘Na POT. +’ (V=76,4 ‘+ OU -‘ 3,0 U ‘mg POT. -1’; ‘K IND.0,5’= 5,3 ‘+ OU -‘ 0,2 mmol ‘L POT. -1’) e ‘NH IND.4 POT.+’ (V=98,9 ‘+ OU -‘ 3,9 U ‘mg POT. -1’; ‘K IND.0,5’= 4,1 ‘+ OU -‘ 0,15 mmol ‘L POT. -1’) ocorreu de acordo com cinética cooperativa. A ouabaína inibiu cerca de 86% da atividade ATPase total, com ‘K IND. I’ = 114,9 ‘+ OU -‘ 5,6 ‘mü’mol ‘L POT. -1’. A (‘Na POT. +’,’K POT. +’)-ATPase branquial de C ornatus aclimatado em ambas as salinidades foram estimuladas sinergisticamente por ‘K POT. +’ e ‘NH IND.4 POT.+’ em torno de 30%. Na presença de concentrações crescente de ‘NH IND.4 POT.+’, a afinidade da enzima por ‘K POT. +’ foi aumentada em 187 vezes para o animal aclimatado a ’33 partes por mil’ e 5% para o ’21 partes por mil’. A atividade (‘Na POT. +’,’K POT. +’)-ATPase da fração microsomal de C. ornatus foi inibida na presença de poliaminas e, a espermidina apresentou uma maior inibição quando comparada a espermina. A presença de poliamina no meio reacional afeta não só a velocidade máxima, como também diminui a afinidade da enzima pelo ATP e aumenta para ‘Na POT. +’. C. ornatus hiporregula a osmolalidade da hemolinfa quando aclimatado durante 10 dias em salinidade de ’33 partes por mil’ (‘delta’=192 mOsm ‘kg POT. -1’ ‘H IND. 2’O) mas é isosmótico depois de aclimatado durante 15 dias a salinidade de ’21 partes por mil’. Além disso, a concentração de ‘Na POT. +’, ‘K POT. +’, ‘Ca POT. 2+’ e ‘Mg POT. 2+’, estimada no animalaclimatado a salinidade de ’15 partes por mil’ durante 15 dias não retorna aos valores iniciais quando o animal está aclimatado à salinidade de ’33 partes por mil’ (‘delta’=65-80%). A atividade (‘Na POT. +’, ‘K POT. +’)-ATPase nas brânquias posteriores de C. ornatus diminuem logo após a exposição a meio externo diluído, recuperando a atividade inicial 1 dia após a transferência, onde o máximo de atividade é observado quando o animal permanece nessa nova salinidade por 10 dias. A expressão relativa da subunidade ‘alfa’ da (‘Na POT. +’, ‘K POT. +’)-ATPase é mais significativa 5 horas após a transferência, aumentando em 24 horas, diminuindo até o valor inicial em 48 horas e aumentando novamente. A análise da atividade (‘Na POT. +’, ‘K POT. +’)-ATPase para as brânquias separadas, revelou um a atividade é 2,5 vezes maior nos animais aclimatados a ’21 partes por mil’ e, embora a atividade tenha aumentado na mesma proporção, foi verificado que na 6° brânquia a atividade é aproximadamente 1,4 vezes maior que a da 7° brânquia. De maneira interessante, porém contrastaste, foi observada uma concentração de (‘Na POT. +’, ‘K POT. +’)-ATPase maior na 7° brânquia comparada a 6° brânquia em ambas as salinidades
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 08.04.2010

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    • ABNT

      GARÇON, Daniela Pereira; LEONE, Francisco de Assis. (Na+,K+)-ATPase branquial e a osmorregulação em crustáceos: efeito da salinidade na expressão e características cinéticas da wnzima de Callinectes ornatus Ordway, 1863 (Crustacea, Portunidae). 2010.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2010.
    • APA

      Garçon, D. P., & Leone, F. de A. (2010). (Na+,K+)-ATPase branquial e a osmorregulação em crustáceos: efeito da salinidade na expressão e características cinéticas da wnzima de Callinectes ornatus Ordway, 1863 (Crustacea, Portunidae). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
    • NLM

      Garçon DP, Leone F de A. (Na+,K+)-ATPase branquial e a osmorregulação em crustáceos: efeito da salinidade na expressão e características cinéticas da wnzima de Callinectes ornatus Ordway, 1863 (Crustacea, Portunidae). 2010 ;
    • Vancouver

      Garçon DP, Leone F de A. (Na+,K+)-ATPase branquial e a osmorregulação em crustáceos: efeito da salinidade na expressão e características cinéticas da wnzima de Callinectes ornatus Ordway, 1863 (Crustacea, Portunidae). 2010 ;


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