Menu



Exportar registro bibliográfico

Tese

Estudo do processamento alternativo e análises do silenciamento das metiltransferases específicas do pistilo de Nicotiana tabacum L. (2008)

  • Authors:
  • Autor USP: CALIXTO, CRISTIANE PAULA GOMES - FMRP
  • Unidade: FMRP
  • Sigla do Departamento: RGE
  • Subjects: SOLANACEAE; GENÉTICA VEGETAL; REPRODUÇÃO VEGETAL
  • Language: Português
  • Abstract: A biologia da reprodução das plantas é uma área de crescente interesse. O pistilo é um órgão de importância central no processo reprodutivo. A espécie Nícotiana tabacum, linhagem Petit Havana SR-1, foi escolhida como modelo para o estudo do pistilo, por possuir flores especializadas e grandes, apresentando todos os principais órgãos facilmente identificáveis. Há diversos genes que são exclusivamente expressos no pistilo. Entre estes, foi encontrado, por nosso grupo de pesquisa, vários transcritos que codificam proteínas com alta similaridade às metiltransferases do ácido salicílico, jasmônico e benzóico. Os ésteres metilados destes ácidos são largamente difundidos no reino vegetal, atuando na regulação do desenvolvimento da planta, reprodução, defesa e sinalização. Este trabalho visou estudar a estrutura destes transcritos e o papel da metiltransferase no processo reprodutivo. Os objetivos específicos foram: 1) realizar experimentos de 5'RACE para estudar a extremidade 5' completa, incluindo a região 5' não traduzida, dos diferentes transcritos da metiltransferase expressa no pistilo; 2) realizar experimentos de 3 'RACE para estudar a extremidade: 3' e identificar os sítios alternativos de poliadenilação nos diferentes transcritos da metiltransferase; 3) analisar a função das metiltransferases por meio do estudo das alterações acarretadas pelo bloqueio de um de seus transcritos, utilizando a técnica do RNAi. Os dados de 5' e 3' RACE obtidos, juntamentecom os diferentes trabalhos realizados em nosso laboratório, indicam que todos os transcritos da metiltransferase possuem o exon 1 para iniciar a tradução, mas diferem significativamente no restante de sua composição de exons e nas escolhas dos sítios de poliadenilação. Análises realizadas com o DNA genômico, confirmaram a presença de pelo menos 2 genes e 3 pseudogenes para a metiltransferase específica do pistilo. Como a linhagem Petit Havana SR-1 em estudo é homozigota para a maioria dos genes, a presença de 5 seqüências distintas sugere a existência de duplicações no genoma, durante a evolução deste gene. Estes genes são formados por 8 exons hipotéticos, divididos em três ou quatro blocos de fase aberta de leitura, intercalados por dois ou três introns, respectivamente. Assim, com os resultados disponíveis até o momento e com todas as análises realizadas neste trabalho, é proposto que as metiltransferases do pistilo de N tabacum sofrem um complexo mecanismo de processamento alternativo, o que pode representar uma vantagem adaptativa no processo reprodutivo desta espécie. Para o estudo da função dos transcritos da metiltransferase específica do pistilo, parte da região codificadora do clone de cDNA 046B 11 foi inserida no vetor de expressão em plantas pK7GWIWG2(I) (RNAi), resultando no plasmídeo pGC2. Este plasmídeo foi utilizado para transformar discos foliares de N. tabacum via Agrobacterium tumefaciens. Um total de 10 plantastransgênicas independentes foram obtidas. A quantificação por RT-PCR em tempo real demonstrou que todos os transgênicos pGC2 apresentaram níveis variáveis na redução da expressão da metiltransferase no pistilo. Todas as plantas presentes na casa de vegetação apresentaram formação e disposição de todas as estruturas reprodutivas corretas, quando comparadas a plantas do grupo controle (linhagem Petit Havana SR-l). Com relação às análises do processo reprodutivo das plantas transgênicas , foram observados baixa taxa de fertilidade em 2 plantas e baixo peso de sementes/flor em 5 plantas (p- valor < 0,01). No entanto, estas observações não foram correlacionadas de maneira convincente ao silenciamento da metiltransferase, pois há a possibilidade disto ter sido causado pelas infecções adquiridas pelas plantas durante as análises. Paralelamente a estes experimentos, a região 5' regulatória de uma das seqüências genômicas da metiltransferase (cerca de 2,7 kb) foi clonada no vetor pPR97, para regular a expressão do gene gus, resultando no plasmídeo pCC2. Este plasmídeo foi utilizado para transformar discos foliares de N. tabacum via A. tumefaciens. Órgãos florais e vegetativos de 13 plantas transformadas com esta construção foram coletados e usados para extração de proteína total e realização de cortes histológicos. Os extratos foram analisados em ensaio fluorimétrico para detecção da atividade da proteína GUS. Os resultados mostraramque a seqüência 5' regulatória da metiltransferase, utilizada por esse projeto, dirigiu a expressão do gus na antera de 12 das 13 plantas transgênicas analisadas. Em 9 dessas mesmas 12 plantas também foi detectada expressão de gus no pistilo, como era esperado. O ensaio histoquímico de duas plantas pCC2 mostram que a expressão no pistilo ocorre nos tecidos vascular e transmissor, e que na antera ocorre no estômio, tecido vascular e grãos-de-pólen. A expressão do gene gus na antera das plantas transgênicas foi inesperada. Este trabalho sugere que os diferentes transcritos das metiltransferases específicas do pistilo de N. tabacum possuem uma importante função biológica nesta espécie. No entanto, experimentos de silenciamento gênico ainda não foram conclusivos para se desvendar suas funções na reprodução. Assim, experimentos adicionais são necessários para elucidar o papel do gene da metiltransferase na biologia da reprodução de N. tabacum
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 03.10.2008
    • How to cite
    A citação é gerada automaticamente e pode não estar totalmente de acordo com as normas

    • ABNT

      CALIXTO, Cristiane. Estudo do processamento alternativo e análises do silenciamento das metiltransferases específicas do pistilo de Nicotiana tabacum L. 2008. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008. . Acesso em: 10 mar. 2026.

    • APA

      Calixto, C. (2008). Estudo do processamento alternativo e análises do silenciamento das metiltransferases específicas do pistilo de Nicotiana tabacum L. (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.

    • NLM

      Calixto C. Estudo do processamento alternativo e análises do silenciamento das metiltransferases específicas do pistilo de Nicotiana tabacum L. 2008 ;[citado 2026 mar. 10 ]

    • Vancouver

      Calixto C. Estudo do processamento alternativo e análises do silenciamento das metiltransferases específicas do pistilo de Nicotiana tabacum L. 2008 ;[citado 2026 mar. 10 ]

    Últimas obras dos mesmos autores vinculados com a USP cadastradas na BDPI:

Digital Library of Intellectual Production of Universidade de São Paulo     2012 - 2026