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Tese

Clonagem e expressão do fator VIII de coagulação humano (2006)

  • Authors:
  • Autor USP: PICANÇO, VIRGINIA PROENÇA - FMRP
  • Unidade: FMRP
  • Sigla do Departamento: RCM
  • Assunto: HEMATOLOGIA
  • Language: Português
  • Abstract: No Brasil existem cerca de 7000 hemofi1icos cadastrados que são tratados, na sua maioria, com concentrados de fator VIII obtidos a partir do plasma humano. Este tipo de tratamento é caro e muitas vezes não disponível na quantidade necessária. Produzir o fator VIII de coagulação por técnicas de engenharia recombinante é desejável com base no pressuposto de menor custo e maior segurança, visto que seriam produtos praticamente isentos de agentes patogênicos, ao contrário do produto obtido do plasma humano. Este trabalho teve como objetivo modificar, introduzir e expressar o fator VIII de plasma humano em linhagens celulares para obter altos níveis de expressão in vitro. Inicialmente, foram realizadas duas construções plasmidiais, uma para a cadeia leve e outra para a pesada do FVIII, em vetores de expressão de células de mamíferos. Células CHO, r Hek-293 e HepG2 foram transfectadas com as construções plasmidiais. O padrão de expressão foi analisado por RT-PCR e por microscopia de fluorescência. As análises de expressão por RT-PCR e imunocitoquímica sugerem que todas as linhagens celulares utilizadas são capazes de expressar as cadeias leve e pesada do FVIII humano, mas em nenhuma destas linhagens foi detectado atividade e FVIII. Isto sugere que a quantidade da proteína secretada nao seja suficiente para detecçao ou que a montagem do FVIII ativo, foi deficiente. Posteriormente, Cinco construções plasmidiais contendo o FVIII sem o domínio B foram construídas comdiferentes promotores (CMV, EF1'alfa', hAAT, fviii). A expressão foi analisada em células 293T, CHO e Hepa1.6. O vetor contendo o promotor EF1a apresentou os maiores níveis de expressão de FVIII em todas as linhagens celulares (293T= 184,4 ng/mL; Hepa1.6= 133,6ng/mL; CHO=38,4 ng/mL). Neste trabalho, também foram utilizados vetores lentivirais contendo, além dos promotores universais CMV e EF-1a, promotores específicos de figado, HAAT e F8p, para observar a ) especificidade dos promotores em linhagens celulares de figado e 293T como controle. Em todas as construções realizadas foi utilizado o cDNA do FVIII sem o domínio B. Todos os promotores foram clonados upstream do FVIII'delta'B dentro do vetor lentiviral t, 1054. As linhagens 293T, HepG2, Hepa1.6 e Sk-Hep foram transduzidas com o vetor lentiviral, as células positivas foram selecionadas e expandidas. O vetor mais efetivo para a produção de FVIII foi aquele com o promotor CMV (1,85 IU/mL para 293T IU/mL; 3,15 IU/mL para HepG2; 5,03 IU/mL para SkHep, 0,91 IU/mL para Hepal.6). Os sistemas mais eficientes para a produção de FVIII foram as linhagens Sk-Hep e HepG2 transduzidas com o vetor com o promotor CMV. O número de cópias dos vetores lentivirais integrados foi determinado por Real Time PCR. O número variou de 1 cópia por célula 293T transduzida com o vetor contendo o promotor EF1-alpha a 68 cópias por célula SkHep transduzida com o vetor contendo o promotor fviii. O FVIII foi produzido mais. eficientementenas células transduzidas com o vetor contendo os promotores universais (CMV e EF1), quando comparado com os outros promotores. E apesar do baixo número de cópias integradas dos vetores (com os promotores CMV e EF1-a), estes apresentaram um alto nível de FVIII ativo. Isto pode indicar uma eficiência da transcrição sob controle dos respectivos promotores, uma eficiência de secreção de FVIII ou uma combinação de ambos. A maior produção de FVIII por cópia de vetor integrado foi observado em SkHep, sob o controle do promotor CMV. Para melhor caracterização do FVIII recombinante secretado pelas linhagens realizado Western blot para análise da proteína. O FVIII foi coletado do sobrenadante das culturas celulares e analisado por SDS-PAGE e imunodetecção. As linhagens celulares transduzidas com nossos vetores apresentaram FVIII processado corretamente nas cadeias leve e pesada, apresentando apenas uma ) pequena fração de FVIII não-processado (170 kDa), indicando que a clivagem intracelular de FVIII nas cadeias leve e pesada pode não ter sido totalmente completa. Paralelamente, experimentos utilizando a droga Hyper-IL6, com o intuito de ativar a proliferação de hepatócitos e vetores lentivirais contendo a proteína EGFP, foram realizados in vitro e in vivo, com o intuito de avaliar se durante a proliferação de hepatócitos há um aumento da transdução lentiviral. Os camundongos que receberam 4µg de Hyper-IL6 e '10 POT. 9' ou '10 POT. 8' partículas virais apresentaramuma maior quantidade de cópias integradas no fígado (estatisticamente significante). Este estudo mostrou que é possível obter altos níveis de FVIII recombinante em cultura de células. Estabelecer linhagens celulares de mamíferos transformadas com construções lentivirais contendo o FVIII que expressem a proteína em níveis elevados, será um passo fundamental para novos avanços na terapêutica da hemofilia e na caracterização dos processos envolvidos na biossíntese do fator VIII. Isto permitirá, também, estabelecer no Brasil a metodologia para a produção de fatores de coagulação por meio de tecnologia de DNA recombinante. Este trabalho também estudou a aplicação de vetores lentivirais in vivo (terapia gênica) e sugere ainda que estes vetores, num futuro próximo, podem ser testados em camupdongos hemofílicos para obtenção de níveis plasmáticos de FVIII
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 20.01.2006
    • How to cite
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    • ABNT

      PICANÇO, Virgínia Proença. Clonagem e expressão do fator VIII de coagulação humano. 2006. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006. . Acesso em: 04 jun. 2025.

    • APA

      Picanço, V. P. (2006). Clonagem e expressão do fator VIII de coagulação humano (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.

    • NLM

      Picanço VP. Clonagem e expressão do fator VIII de coagulação humano. 2006 ;[citado 2025 jun. 04 ]

    • Vancouver

      Picanço VP. Clonagem e expressão do fator VIII de coagulação humano. 2006 ;[citado 2025 jun. 04 ]

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