Estudo da glucoamilase e da alfa-amilase produzidas pelo fungo Paecilomyces variotii: purificação, caracterização bioquímica e relações filogenéticas (2005)
- Authors:
- Autor USP: MICHELIN, MICHELE - FFCLRP
- Unidade: FFCLRP
- Sigla do Departamento: 592
- Subjects: BIOQUÍMICA MICROBIANA; CITOLOGIA; BIOLOGIA CELULAR
- Keywords: Amilase; Paecilomyces variotii; Termotolerante
- Language: Português
- Abstract: Amilases microbianas têm aplicações biotecnológicas principalmente na conversão de amido para xaropes de maltose ou glicose. O objetivo deste trabalho foi estudar amilases produzidas pelo fungo Paecilomyces variotii, isolado de folhas de Psidium guajava. As melhores condições para produção enzimática foram padronizadas, usando o meio SR, pH 7,0, suplementado com farinha de aveia 1,5% como fonte de carbono, inoculado com 1,75x10 POT.8 conídios/mL, a 30°C, sem agitação, por 6 dias. O fungo desenvolveu-se em uma ampla faixa de pH (3-8), concentração osmótica (0-15% NaCl), e altas temperaturas (até 45°C), o que o caracteriza como um microrganismo tolerante a ambientes extremos. As amilases foram purificadas por seqüencial eluição em cromatografias de DEAE-celulose e Sephadex G-100, sendo nesta última separada em duas formas amilolíticas (PI e PII). PI foi submetido em eletroeluição resultando em uma 'alfa'- amilase com 16.1 vezes de purificação com 8,9% de recuperação. PII foi caracterizado como uma glucoamilase, com recuperação e fator de purificação de 6,2% e 47,9 vezes, respectivamente. Análises em PAGE confirmou o grau de homogeneidade e o caráter amilolítico ('alfa'-amilase e glucoamilase) após revelação dos géis com iodo ou glicose- oxidase. Esses resultados foram confirmados através de TLC, onde maltose e maltotriose foram os principais produtos de hidrólise do amido para PI e somente glicose para PII 'alfa'-amilases e glucoamilase apresentaram massasmoleculares (SDS-PAGE) de 75 kDa e 86,5 kDa, com pH e temperatura ótimos de 4,0 e '60 GRAUS' C, e 5,0 e '55 GRAUS' C, respectivamente. Em relação à estabilidade, ambas enzimas foram estáveis até '60 GRAUS' C. Temperaturas superiores levaram a instabilidade e uma diminuição das atividades. As amilases foram estáveis em todos os pHs testados (2,5 - 8,0), sendo maior em pH ácido para a glucoamilase e o contrário para 'alfa' amilase. Amido favorece a ... estabilidade da glucoamilase, mas esta foi inibida por glicose, já para 'alfa'-amilase o amido atuou como protetor da enzima em períodos superiores a 40 minutos e esta não sofreu inibição pelo produto final. O ponto isoelétrico e o conteúdo de carboidratos foram de 3,5 e 27,5% para a glucoamilase e 4,5 e 23% para a 'alfa'-amilase, respectivamente. A glucoamilase e a 'alfa'-amilase de P. variotii hidrolisaram preferencialmente amido Reagen® e Sigma®. Constante de Michaelis e Vmáx foram determinados para vários substratos, podendo estimar uma eficiência catalítica favorável a amilopectina para a glucoamilase e amido Reagen para a 'alfa'-amilase. A atividade glucoamilásica foi ensaiada com vários íons metálicos, mas somente 'Mn POT 2+' 5mM aumentou a atividade em 80,7%. A 'alfa'-amilase foi ativada por 1 mM de 'Ca POT.2+' (65%) e 'CO POT.2+' (60%). Análises de dicroísmo circular forneceram alguns dados sobre a estrutura dessas enzimas, sendo que, a glucoamilase mostrou-se rica em 'alfa'-hélices ea 'alfa'- amilase uma mistura de 'alfa'-hélices e folhas 'beta'. Através de análises em Western Blotting foi possível determinar pouca homologia entre as glucoamilases produzidas por Paecilomyces variotti e Scytalidium thermophilum, o que é condizente com os dados encontrados na literatura, uma vez que o gênero Paecilomyces encontra-se mais próximo, do ponto de vista evolucionário, de Talaromyces. Esses dados foram confirmados com a realização de espectrometria de massa para a glucoamilase de P. variotii, no qual um fragmento de aminoácidos da glucoamilase deste microrganismo apresentou homologia com a glucoamilase de T. emersonii
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2005
- Data da defesa: 30.06.2005
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ABNT
MICHELIN, Michele. Estudo da glucoamilase e da alfa-amilase produzidas pelo fungo Paecilomyces variotii: purificação, caracterização bioquímica e relações filogenéticas. 2005. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2005. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59139/tde-06072007-110106/. Acesso em: 18 nov. 2024. -
APA
Michelin, M. (2005). Estudo da glucoamilase e da alfa-amilase produzidas pelo fungo Paecilomyces variotii: purificação, caracterização bioquímica e relações filogenéticas (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59139/tde-06072007-110106/ -
NLM
Michelin M. Estudo da glucoamilase e da alfa-amilase produzidas pelo fungo Paecilomyces variotii: purificação, caracterização bioquímica e relações filogenéticas [Internet]. 2005 ;[citado 2024 nov. 18 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59139/tde-06072007-110106/ -
Vancouver
Michelin M. Estudo da glucoamilase e da alfa-amilase produzidas pelo fungo Paecilomyces variotii: purificação, caracterização bioquímica e relações filogenéticas [Internet]. 2005 ;[citado 2024 nov. 18 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59139/tde-06072007-110106/
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