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Tese

Potencial dos fungos Aspergillus terricola e Aspergillus ochraceus no desenvolvimento de bioprocessos e propriedades das enzimas xilanolíticas (2009)

  • Authors:
  • Autor USP: MICHELIN, MICHELE - FFCLRP
  • Unidade: FFCLRP
  • Sigla do Departamento: 592
  • Subjects: ASPERGILLUS; ENZIMAS (ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO)
  • Language: Português
  • Abstract: Aspergillus terricola e Aspergillus ochraceus foram selecionados entre 35 fungos filamentosos para estudo de xilanases. Estes apresentaram condições ótimas de cultivo em meios Vogel e Adams, respectivamente, suplementados com xilana birchwood 1%, incubados a \201830 GRAUS\2019C em condições estáticas, por 144 h para A. terricola e 120 h para A. ochraceus. Para A. terricola, altos níveis xilanolíticos também foram observados em meio adicionado de farelo de trigo. Máxima atividade de xilanase foi obtida a \201860 GRAUS\2019C e pH 6,5 para A. terricola, e \201865 GRAUS\2019C e 5,0 para A. ochraceus. Xilanase de A. terricola foi completamente estável a \201855 GRAUS\2019C por 2 h, apresentando um \2018t IND 50\2019 de cerca de 80 min a \201860 GRAUS\2019C e 10 min a \201865 GRAUS\2019C, enquanto a xilanase de A. ochraceus foi estável por 2 h a \201850 GRAUS\2019C, exibindo um \2018t IND 50\2019 em tomo de 65 min a \201855 GRAUS\2019C e 10 min a \201860 GRAUS\2019C. As xilanases produzidas por ambos os microrganismos foram estáveis em toda faixa de pH testada (2,5-8,0), por 1 h. Os maiores níveis de \2018beta\2019-xilosidase foram produzidos por A. ochraceus. Esta enzima apresentou temperatura e pH ótimos a \201875 GRAUS\2019C e 3,0-5,0, respectivamente, e estabilidade até \201860 GRAUS\2019C (pelo menos 50% da atividade inicial) em todos os pH testados, por 1 h. Preparações enzimáticas de A. terricola e A. ochraceus foram utilizadas no branqueamento da polpa de celulose: xilanases de A. ochraceus diminuíram 4,3 pontos do número kappa (correspondendo a uma eficiência de deslignificação de 36,4%), aumentaram 2,4% ISO na alvura e mantiveram a viscosidade; xilanases de A. terricola reduziram 1,1 pontos do kappa, aumentaram 3,4% ISO na alvura e reduziram 8,6% a viscosidade. Análises das polpas de celulose biobranqueadas em MEV mostrou desfibrilação das microfibrilas. Licores de palha de trigo e sabugo de milho com 5, 15, 30 e 50 min de autohidrcombinação, ou isoladamente, com farelo de trigo e sabugo de milho, respectivamente, como substratos para a indução enzimática A melhor produção foi obtida com os licores de palha de trigo e sabugo de milho com 15 e 30 min de autohidrólise, respectivamente, em combinação com os seus relativos resíduos. Aumentos em tomo de 20- 30% para as atividades xilanásica e \2018beta\2019-xilosidásica de A. ochraceus foram observados quando comparados com xilana birchwood. Para A. terricola foram observados aumentos de 50 a 90% para a \2018beta\2019-xilosidase utilizando 100% do licor de palha de trigo. Escalonamento da produção enzimática foi realizado em biorreatores STR e do tipo Air-lift para A. terricola, utilizando farelo de trigo 0,5% como substrato. Verificou-se que aeração e condição de inóculo influenciaram significantemente na produção enzimática, e que os maiores níveis enzimáticos foram observados no reator Air-lift. Produção das enzimas xilanolíticas foi detectada quando A. ochraceus foi cultivado no reator STR utilizando farelo de trigo 1 % adicionado de licor de palha de trigo 10% com 15 min de autohidrólise. Para os propósitos de purificação das endoxilanases e \2018beta\2019-xilosidase produzidas por A. ochraceus foi utilizado um sistema de cultivo em dois-estágios, sendo inicialmente usado um meio rico para o crescimento do fungo e posteriormente um meio para a indução de xilanases. O extrato bruto obtido foi aplicado em colunas cromatográficas DEAE-celulose e diferentes tipos de filtração (Biogel P-60 e Sephadex G-l00) onde se obtiveram: uma endoxilanase parcialmente purificada (xil 1), e duas endoxilanases (xil 2 e xil 3) e uma \2018beta\2019-xilosidase (\2018beta\2019-xil) purificadas. As massas moleculares corresponderam a 39 kDa ou 28 kDa para a "xil 1"; 25 kDa -"xil 2"; 33 kDa -"xil 3", e 137 kDa \2013\2018beta\2019-xil por SDS-PAGE. Análises em TLC confirmaram tratar-se de endoxilanases e \2018beta\2019-xilosidase. As temperaturas ótimas foram \201860 GRAUS\2019C e \201870 GRAUS\2019C, respectivamente. O pH ótimo da "xil 1" e "xil 2" foi estimado em 6,0; da "xil 3" em 5,5 e da \2018beta\2019-xil em 4,5. Em relação à termoestabilidade, a "xil 1" foi estável a \201850 GRAUS\2019C por 30 min, e a \201955 GRAUS\2019C apresentou um \2018t IND 50\2019 de 20 min. A "xil 2" foi estável a \201950 GRAUS\2019C e \201855 GRAUS\2019C por 1 h, e a \201860 GRAUS\2019C apresentou um \2018t IND 50\2019 de 25 min. A "xil 3" foi completamente estável a \201850 GRAUS\2019C e \201955 GRAUS\2019C por 1 h, e a \201960 GRAUS\2019C manteve mais de 60% da atividade residual. A \2018beta\2019-xil foi estável a \201960 GRAUS\2019C e a \201970 GRAUS\2019C por 1 h. Em relação ao pH, a "xil 1" e "xil 3" foram estáveis na faixa de pH 3,0 -8,0 durante 1 h. A "xil 2" foi estável em pH 4,0 a 8,0; e a beta-xil de pH 3,0 a 6,5. As endoxilanases "xil 1 ", "xil 2" e "xil 3", e a \2018beta\2019-xil apresentaram-se como glicoproteínas com cerca de 74%, 67%, 20% e 39% de carboidrato, respectivamente. As atividades de "xil 1" e "xil 2" aumentaram na presença de Mn\2018Cl IND 2\2019e Co\2018Cl IND 2\2019- 5 e 10mM. Manganês (1mM) também foi favorável para a atividade da "xil 3", e para a \2018beta\2019-xil nenhum íon ativou-a de forma significativa. As endoxilanases hidrolisaram preferencialmente xilana birchwood à oat spelt, enquanto a \2018beta\2019-xilosidase hidrolisou os substratos sintéticos pNF-xilopiranosídeo e pNF-glucopiranosídeo, respectivamente, no entanto, em sítios ativos diferentes. Os valores de \2018K IND M\2019 e \2018V IND máx\2019 sugerem que a "xil 1" apresenta maior afinidade e eficiência catalítica por xilana birchwood do que a "xil 2" e a "xil 3". O valor de \2018K IND M\2019 e \2018V IND máx\2019 calculado para a \2018beta\2019-xil frente ao substrato pNF-xilopiranosídeo foi de 0,18 mg/mL e 39,34 U/mg proteína, respectivamente. Análises de dicroísmomostraram-se caracteristicas de proteínas ricas em folha \2018beta\2019 enquanto para a \2018beta\2019- xilosidase foi observada uma mistura de \2018alfa\2019-hélice e folha \2018beta\2019 As análises de sequenciamento de aminoácidos mostraram identidade entre as sequências das xilanases e \2018beta\2019-xilosidase de A. ochraceus e proteínas hipotéticas de outras espécies Aspergillus, e de outros fungos; além disso, a "xil 3" mostrou identidade com outras enzimas do sistema xilanolítico
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 10.12.2009
    • How to cite
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    • ABNT

      MICHELIN, Michele. Potencial dos fungos Aspergillus terricola e Aspergillus ochraceus no desenvolvimento de bioprocessos e propriedades das enzimas xilanolíticas. 2009. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009. . Acesso em: 19 abr. 2024.

    • APA

      Michelin, M. (2009). Potencial dos fungos Aspergillus terricola e Aspergillus ochraceus no desenvolvimento de bioprocessos e propriedades das enzimas xilanolíticas (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.

    • NLM

      Michelin M. Potencial dos fungos Aspergillus terricola e Aspergillus ochraceus no desenvolvimento de bioprocessos e propriedades das enzimas xilanolíticas. 2009 ;[citado 2024 abr. 19 ]

    • Vancouver

      Michelin M. Potencial dos fungos Aspergillus terricola e Aspergillus ochraceus no desenvolvimento de bioprocessos e propriedades das enzimas xilanolíticas. 2009 ;[citado 2024 abr. 19 ]

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