Produção e análise de anticorpos anti-sítio fosforilado e não fosforilado na cauda da molécula de Miosina-Va: passos para obter anticorpos monoclonais (2002)
- Authors:
- Autor USP: PRANCHEVICIUS, MARIA CRISTINA DA SILVA - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RBP
- Subjects: BIOLOGIA CELULAR; BIOLOGIA MOLECULAR
- Language: Português
- Abstract: A miosina-Va é um motor molecular que se liga a actina ela é formada por duas cadeias pesadas idênticas e várias cadeias leves. Cada cadeia pesada consiste de três domínios: um domínio motor amino-terminal com sítios ligantes para actina e ATP; um domínio pescoço regulatório composto de seis motivos Ia que se liga calmodulina e cadeias leves; um domínio cauda estruturalmente distinto dentro da superfamília de miosinas, que pode estar envolvido em ligações com cargas e/ou outras interações proteína-proteína dentro da célula. O domínio cauda pode ser dividido em uma região proximal que predomina estrutura coiled-coil, uma região medial formada pelo intercalamento de estruturas coiled-coil e globular e uma outra região carboxi-terminal globular. Miosina-Va é um fósforo-substrato para uma proteína quinase II dependente de calmodulina (CaMKII), ela se liga a CamKII via uma região da cauda proximal/medial. Em melanóforos de Xenopus, o ciclo celular depende da fosforilação da miosina-Va que regula sua ligação a melanossomos. A quinase específica para esta fosforilação e o sítio têm sido identificado como: CamKII e serina 1650 no domínio cauda globular da miosina-Va. No presente estudo nós temos nos comprometido a gerar anticorpos monoclonais contra o sítio de fosforilação, com o propósito de que este será usado como sonda para investigar o papel funcional da fosforilação sobre miosina-Va em vários tecidos e linhagens celulares. Os seguintes peptídeos sintéticos,correspondendo ao sítio de fosforilação foram obtidos comercialmente: PEP1 -G1643LRKRTSS(PO4)IADE1654 onde S representa a serina fosforilada; PEP2 -G1643LRKRTSSIADE1654; e PEP3 -CL1644RKRTSS(PO4)IADE1654. Os peptídeos PEP1 e PEP2 foram cojugados com Keyhole Limpets Hemocyanin (KLH) via regiões carboxi-terminal usando 1-ethyl-3-(3- dimethyllaminopropyl)-carbodiimide (EDCI). PEP3 foi conjugado a KLH via sua cisteína amino-terminal usando m-maleimidobenzoyl ) -N-hydroxysuccinimide ester (MBS). Inoculações dos conjugado antigênicos foram feitas em camundongos Balb/c e a imunoreatividade do soro foi determinada através de ensaios de Western-blot e ELISA. Nossos resultados indicaram que o conjugado produzido via ligação cisteína foi mais antigênico do que os outros conjugados e produziu uma imuno-resposta muito mais específica. Hibridomas têm sido produzidos com células esplênicas de vários camundongos que apresentou imunoreatividade para miosina-Va fosforilada e/ou não fosforilada. Análises, através de ELISA, dos sobrenadantes dessas culturas de hibridomas têm demonstrado a secreção de distintos anticorpos contra miosina-Va fosforilada e não fosforilada. A expansão celular de hibridomas positivos e a seleção de clones positivos deverá resultar em linhagens celulares produzindo anticorpos monoclonais contra miosiana-Va fosforilada na serina 1650
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2002
- Data da defesa: 16.09.2002
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ABNT
PRANCHEVICIUS, Maria Cristina da Silva. Produção e análise de anticorpos anti-sítio fosforilado e não fosforilado na cauda da molécula de Miosina-Va: passos para obter anticorpos monoclonais. 2002. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2002. . Acesso em: 27 dez. 2025. -
APA
Pranchevicius, M. C. da S. (2002). Produção e análise de anticorpos anti-sítio fosforilado e não fosforilado na cauda da molécula de Miosina-Va: passos para obter anticorpos monoclonais (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. -
NLM
Pranchevicius MC da S. Produção e análise de anticorpos anti-sítio fosforilado e não fosforilado na cauda da molécula de Miosina-Va: passos para obter anticorpos monoclonais. 2002 ;[citado 2025 dez. 27 ] -
Vancouver
Pranchevicius MC da S. Produção e análise de anticorpos anti-sítio fosforilado e não fosforilado na cauda da molécula de Miosina-Va: passos para obter anticorpos monoclonais. 2002 ;[citado 2025 dez. 27 ]
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