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Tese

Clonagem e expressão do fator IX da coagulação sangüínea humana em células de mamíferos (2014)

  • Authors:
  • Autor USP: FERNANDES, ANDRIELLE DE CASTILHO - FMRP
  • Unidade: FMRP
  • Sigla do Departamento: RCM
  • Subjects: HEMOFILIA; FATORES DE COAGULAÇÃO SANGUÍNEA; ANTICORPOS
  • Language: Português
  • Abstract: A hemofilia B é uma doença ligada ao cromossomo X e consiste na deficiência do fator IX da coagulação sanguínea. O cDNA relativo ao fator IX apresenta 1.4 kb e codifica uma proteína de 281 aminoácidos e peso molecular de 57 kDa. Atualmente, existe no Brasil cerca de 1300 pacientes hemofílicos B e a forma de tratamento envolve o uso do fator IX derivado do plasma (pdFIX). O custo deste produto é muito elevado e está sujeito a contaminação viral que não é eliminada por completo durante o processo de purificação do pdFIX. Isso gera incentivo para a produção do mesmo em sistemas celulares in vitro de origem brasileira, livre de agentes infecciosos. O objetivo principal desse trabalho consistiu em clonar e expressar o cDNA relativo ao FIX da coagulação sanguínea humana em células de mamífero utilizando o sistema retroviral. A estratégia experimental consistiu em isolar e clonar o cDNA a partir de um clone de cDNA previamente isolado de uma biblioteca de fígado humano. O cDNA relativo ao fator IX foi isolado deste clone por meio de PCR e subseqüentemente foi submetido a digestão com enzimas de restrição especificas para a clonagem no vetor retroviral pLXIN. Em seguida foi confirmada a autenticidade do clone recombinante por meio do sequenciamento de DNA. O vetor de expressão recombinante, pLXIN-rFIX, foi transfectado na linhagem produtora de retrovírus Eco-Pack2™-293. Pela técnica de "ping-pong" os vírus produzidos por essa linhagem EcoPack2™ -293/rFIX+ foram utilizados para infectar a linhagem empacotadora de retrovírus Retro-Pack2™-PT67. A análise por citometria de fluxo mostrou que a população RetroPack2™-PT67/rFIX+ apresenta elevados níveis de rFIX, da ordem de 96%. Finalmente, os vírus produzidos pela RetroPack2™-PT67/rFIX+ foram utilizados para transduzir três linhagens celulares de mamífero: CHO, Hek-293 e Hep-G2. A presença do mRNA relativo ao FIX foi mostradonas três linhagens recombinantes por RT-PCR. Também a presença da proteína citoplasmática rFIX foi demonstrada por citometria de fluxo nas três linhagens celulares em diferentes níveis (CHO/‘rFIX POT.+’ - 14,5%; Hek-293/ ‘rFIX POT.+’ - 21% e Hep-G2/‘rFIX POT.+’ - 46%). Em seguida, a análise da atividade biológica do rFIX produzido por essas linhagens celulares mostrou a secreção de altos níveis de FIX biologicamente ativo, em duas linhagens Hep-G2/rFIX+ (2,4 IU/mL/24 h) e Hek293/rFIX+ (11 IU/mL/24 h) e a ausência do mesmo na linhagem CHO/rFIX+. Finalmente, os sobrenadantes das culturas que mostraram apresentar o FIX biologicamente ativo foi caracterizado por western blot confirmando a presença de uma banda imunoreativa esperada de 57 kDa. Em conjunto, esse trabalho mostrou a potencialidade do sistema retroviral para a expressão do FIX humano em linhagens celulares de mamífero e a existência de peculiaridades em cada linhagem as quais podem proporcionar diferentes níveis de expressão e produção do FIX biologicamente ativo. Esse trabalho permitiu estabelecer toda a tecnologia para geração de linhagens celulares transgênicas produtoras de rFIX e futuros estudos em modelos animais poderão ser conduzidos para a elucidação minuciosa da molécula recombinante rFIX aqui gerada
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 31.05.2007
    • How to cite
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    • ABNT

      FERNANDES, Andrielle de castilho. Clonagem e expressão do fator IX da coagulação sangüínea humana em células de mamíferos. 2014. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014. . Acesso em: 25 set. 2024.

    • APA

      Fernandes, A. de castilho. (2014). Clonagem e expressão do fator IX da coagulação sangüínea humana em células de mamíferos (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.

    • NLM

      Fernandes A de castilho. Clonagem e expressão do fator IX da coagulação sangüínea humana em células de mamíferos. 2014 ;[citado 2024 set. 25 ]

    • Vancouver

      Fernandes A de castilho. Clonagem e expressão do fator IX da coagulação sangüínea humana em células de mamíferos. 2014 ;[citado 2024 set. 25 ]

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