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Transplante de células-tronco mesenquimais hepáticas produtoras de fator IX humano em camundongos hemofílicos B (2011)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: FERNANDES, ANDRIELLE DE CASTILHO - FMRP
  • Unidades: FMRP
  • Sigla do Departamento: RCM
  • Subjects: HEMOFILIA; CÉLULAS-TRONCO; MUTAGÊNESE
  • Language: Português
  • Abstract: Hemophilia B é uma doença genética ligada ao cromossomo X e consiste na deficiência do fator IX (FIX) da coagulação sanguínea. O fígado é o principal local de síntese da proteína FIX e uma fonte alternativa para obtenção de células-tronco mesenquimais (CTMs). Postula-se que as CTMs são imunoprivilegiadas e podem se enxertar em receptores imunocompetentes após transplante alogênico, além de serem considerados potenciais veículos de entrega de proteínas com efeito terapêutico. Portanto, nós testamos a hipótese de que o transplante alogênico de CTMs derivadas do fígado (fCTMs) e modificadas geneticamente para expressar a proteína recombinante FIX (rhFIX) pode corrigir o fenótipo da hemofilia B murina. Para isso, as fCTMs foram isoladas do fígado de camundongos FVB-GFP e co-transduzidas para expressar o rhFIX e a Luciferase como gene repórter. As fCTMs/rhFIX/Luc foram caracterizadas e infundidas intravenosamente, intraperitonealmente e intrahepáticamente em camundongos hemofílicos B (B6.129P2-‘F9 POT. tm1Dws/J’) submetidos à lesão hepática via tetracloreto de carbono (0,265 g/Kg) e a correção do fenótipo da hemofilia foi avaliada. Além disso, as fCTMs/rhFIX/Luc foram infundidas intrahepáticamente em camundongos FVB-GFP submetidos a mesma lesão hepática e a atividade biológica do rhFIX foi avaliada. Por fim, as fCTMs não modificadas ou fCTMs/rhFIX ou fCTMs/rhFIX/Luc em matrigel foram implantadas subcutaneamente em dois grupos: modelo singênico (FVB-GFP) e alogênico (hemofílico B) para a análise de rejeição celular. Os resultados demonstraram que as fCTMs mantiveram a morfologia fibroblastóide, o perfil imunofenotipico similar as CTMs murinas e o cariótipo normal após as modificações gênicas in vitro. Além disso, as fCTMs não modificadas ou fCTMs/rhFIX ou fCTMs/rhFIX/Luc não apresentaram potencial tumorigênico in vivo. Quando cultivadas em meio definido, fCTMs não modificadas e asfCTMs/rhFIX/Luc foram capazes de se diferenciar em adipócitos e osteócitos. Após o tratamento com vitamina K, as fCTMs/rhFIX/Luc secretaram 210 ‘+ OU –‘ 10 mUI/ ‘10 POT. 6’/24h de rhFIX biologicamente ativo. O transplante alogênico mostrou o aprisionamento celular pulmonar imediatamente após a infusão intravenosa das células (8,83x ‘10 POT. 5’ ‘+ OU -‘ 2,11x ‘10 POT. 5’ f/s) e no 4° dia o deslocamento celular para a região abdominal (1,27x ‘10 POT. 5’ ‘+ OU –‘ 2,33x ’10 POT. 4’ f/s). No 15° dia houve um aumento de 32,8% da bioluminescência (1,34x ’10 POT. 5’ ‘+ OU –‘ 7,54x ’10 POT. 4 f/s), indicando enxertia e proliferação celular. Entretanto, no 21° e 30° dia os níveis voltaram a cair (3,10x ’10 POT. 4 ‘+ OU –‘ 2,52x ‘10 POT. 4’ e 2,35x ‘10 POT. 4’ ‘+.OU.-‘ 2,18x ‘10 POT. 4’ f/s). Quanto à atividade biológica no plasma dos camundongos transplantados observou-se níveis elevados do rhFIX (0,78 ‘+.OU.-‘ 0,28 Ul/mL) no 3° dia, uma queda (0,35 ‘+.OU.-‘ 0,11 Ul/mL) no 5° dia e no 15º dia esses níveis voltaram a subir (0,4 ‘+ OU –‘ 0,12 UI/mL), o que representa um aumento significativo em relação ao animal hemofílico B controle (0,03 ‘+.OU.-‘ 0,02 UI/mL). Contudo no 21º dia os níveis voltaram a cair (0,18 ‘+ OU –‘ 0,07 UI/mL) e 30º os niveis permaneceram baixos (0,07 ‘+ OU –‘ 0,003 UI/mL), mas 2,3 vezes superior ao animal hemofílico B controle. O transplante alogênico via infusão intraperitoneal demonstrou forte correlação positiva (r=0,97) entre a bioluminescência emitida e atividade biológica do rhFIX. No 2º dia após o transplante as células mantiveram na região hepática (8,88x ‘10 POT. 6’ ‘+.OU.-‘ 3,75x ’10 POT. 6’ f/s) e níveis consideráveis de rhFIX foram observados (0,45 ‘+ OU –‘ 0,06 UI/mL). No 4º dia foi detectado um aumento significativo de 94% na bioluminescência(1,7x ‘10 POT. 7’ f/s) e 45,5% no nível do rhFIX (0,65 ‘+ OU –‘ 0,17 UI/mL), indicando proliferação celular. Até o 21º dia foi observado uma queda sutil da bioluminescência (5,28x ‘10 POT. 3’ ‘+ OU –‘ 2,05x ‘10 POT. 3’ f/s) e do rhFIX (0,05 ‘+ OU –‘ 0,001 UI/mL), indicando morte celular. Mesmo com a perda celular, a atividade biológica do rhFIX nos animais transplantados foi de 1,6 vezes superior do que no camundongo controle. O transplante alogênico via infusão intra-hepática demonstrou forte correlação positiva r=0,98) entre a bioluminescência emitida e atividade biológica do rhFIX. No 2° dia após o transplante um pico bioluminescente (1,13x ‘10 POT. 7’ ‘+ OU –‘ 4,61x ’10 POT. 6’ f/s) e niveis consideráveis de rhFIX plasmático (0,58 ‘+ OU –‘ 0,16 Ul/mL) foram observados. A partir do 4° dia até o 21° dia foi observado uma queda sequencial da bioluminescência (4° dia: 7,79x ‘10 POT. 6’ ‘+ OU –‘ 3,46x ‘10 POT. 6’ f/s; 21° dia: 1,34x ‘10 POT. 3’ ‘+ OU –‘ 4,52x ‘10 POT. 2’ f/s) e do rhFIX (4° dia: 0,49 ‘+ OU –‘ 0,21; 21° dia: 0,04 ‘+ OU –‘ 0,02 Ul/mL), indicando morte das células transplantadas. Finalmente, o transplante singênico via infutrasão intra-hepática demonstrou uma correlação positiva (r=0,69) entre a bioluminescência emitida e atividade biológica do rhFIX. No 2° dia após o transplante um pico bioluminescente (2,15x ‘10 POT. 7’ ‘+ OU –‘ 7,18x ‘10 POT. 6’ f/s) e niveis consideráveis de rhFIX plasmático (2,4 ‘+ OU –‘ 0,75 Ul/mL) foram observados. A partir do 4° dia até o 30° dia foi observado uma queda sequencial da bioluminescência (4° dia: 1,13x ‘10 POT. 7’ ‘+ OU –‘ 2,85x ‘10 POT. 6’ f/s; 30° dia: 7,69x ‘10 POT. 5’ ‘+ OU –‘ 6,06x ‘10 POT. 5’ f/s) e do rhFIX (4° dia: 1,78 ‘+ OU –‘ 0,78; 30° dia: 0,79 ‘+ OU –‘ 0,39 Ul/mL),indicando morte de quase todas as células transplantadas. Com relação ao experimento de implante celular, observou-se após 15 dias uma queda de 44% da bioluminescência no modelo singênico, enquanto que no modelo alogênico o sinal não foi detectado. Quanto aos linfócitos T infiltrados detectou-se uma maior quantidade nos implantes alogênicos quando comparados ao singênico, e maior proporção de CD3/CD8 do que CD3/CD4. Logo, conclui-se que é possivel isolar as CTMs do figado murino, modificá-las geneticamente com vetares virais e detectar nivela significativos da proteina rhFIX in vitro e in vivo. Esses dados sugarem a correção temporária do fenótipo da hemofilia B murina, por meio do transplante alogênico de CTMs produtoras de rhFIX, e indica que as CTMs são importantes carreadores de proteínas recombinantes com potencial terapêutico. Adicionalmente, este trabalho aponta a relevância da histocompatibilidade para a aplicação terapêutica das CTMs
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 26.08.2011

  • How to cite
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    • ABNT

      FERNANDES, Andrielle de Castilho; COVAS, Dimas Tadeu. Transplante de células-tronco mesenquimais hepáticas produtoras de fator IX humano em camundongos hemofílicos B. 2011.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2011.
    • APA

      Fernandes, A. de C., & Covas, D. T. (2011). Transplante de células-tronco mesenquimais hepáticas produtoras de fator IX humano em camundongos hemofílicos B. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
    • NLM

      Fernandes A de C, Covas DT. Transplante de células-tronco mesenquimais hepáticas produtoras de fator IX humano em camundongos hemofílicos B. 2011 ;
    • Vancouver

      Fernandes A de C, Covas DT. Transplante de células-tronco mesenquimais hepáticas produtoras de fator IX humano em camundongos hemofílicos B. 2011 ;


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