Produção e caracterização de proteínas quiméricas contendo fosfatases e módulo de ligação à celulose (2011)
- Authors:
- Autor USP: GONçALVES, LARISSA MARTINS - IQ
- Unidade: IQ
- Sigla do Departamento: QBQ
- Subjects: ENZIMOLOGIA; BIOTECNOLOGIA; ENZIMAS
- Language: Português
- Abstract: Introdução e Objetivos. Fosfatases são enzimas promissoras para aplicação na degradação de organofosforados. Por exemplo, a enzima paraoxonase 1 (PON1), associada à lipoproteína de alta densidade (HDL), hidrolisa lactonas, ésteres aromáticos e compostos organofosforados (OP) neurotóxicos. "Módulos de ligação a carboidrato" (CBM) têm diversas aplicações biotecnológicas. Nosso objetivo é a obtenção de proteínas quiméricas contendo fosfatases ligadas a um módulo de ligação de celulose, o que possibilitaria a imobilização dessas enzimas em suportes de celulose. Resultados. Como prova de conceito, uma proteína quimérica contendo uma "fosfatase ácida" (appA) de E.coli e CBM familia 2 (CBM2) de uma celulase de Xanthomonas axonopodis pv citri foi montada e produzida em E. coli como uma proteína recombinante solúvel. appA-CBM2 purificada demonstrou ser totalmente funcional exibindo atividade de ligação à celulose microcristalina (Avicel PH101) e atividade de fosfatase sobre p-nitrofenil fosfato. A ligação à Avicel evidenciou um comportamento de saturação descrito por uma "constante de ligação" (´KIND.b´) de 26 mg e um "máximo de ligação" (´BIND.max´) de 4,45 U/µg. Além disso, a ligação de appA-CBM2 em Avicel foi maior em pH 2,5 e diminuiu acima de pH 6,5, como observado anteriormente para CBM2. Finalmente, o efeito de concentração de p-nitrofenil fosfato na atividade catalítica de appA-CBM2 e appA foi idêntico, exibindo um ´kIND.m´ de 2,8 mM. Portanto, esses dados mostram que o conceito de uma proteína que combina as propriedades da fosfatase e do domínio de ligação à celulose é possível e funcional. De forma similar, os segmentos de DNA que codificam para o CBM2 e para a PON1 de Homo sapiens, foram fusionados resultando em um segmento que codifica para uma proteína quimérica (PON1-CBM2). PON1 nativa e PON1-CBM2 foram produzidas naforma solúvel e ativa em E.coli cepa Arctic. Embora não tenha sido viável sua purificação, estas enzimas foram caracterizadas. PON1-CBM2 liga-se em Avicel PH101 com um comportamento de saturação, descrito por uma constante de ligação (´KIND.b´) de 27 mg, valor idêntico àquele observado para appA-CBM2, o que sugere que o domínio CBM2 é igualmente funcional nestas duas enzimas quiméricas. PON1-CBM2 também exibe atividade paraoxonásica com ´kIND.m´ similar àquele observado para PON1 nativa (1,3 mM), sugerindo que o "domínio" PON1 encontra-se totalmente funcional na enzima quimérica. Conclusão. Uma estratégia para a construção e expressão heteróloga em E. coli de PON1 e das enzimas quiméricas appA-CBM2 e PON1-CBM2 foi desenvolvida. As enzimas quiméricas mostraram-se totalmente funcionais e conservaram as propriedades de seus "domínios" constituintes
- Imprenta:
- Data da defesa: 20.12.2011
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ABNT
GONÇALVES, Larissa Martins. Produção e caracterização de proteínas quiméricas contendo fosfatases e módulo de ligação à celulose. 2011. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-28032012-083445/. Acesso em: 19 set. 2024. -
APA
Gonçalves, L. M. (2011). Produção e caracterização de proteínas quiméricas contendo fosfatases e módulo de ligação à celulose (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-28032012-083445/ -
NLM
Gonçalves LM. Produção e caracterização de proteínas quiméricas contendo fosfatases e módulo de ligação à celulose [Internet]. 2011 ;[citado 2024 set. 19 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-28032012-083445/ -
Vancouver
Gonçalves LM. Produção e caracterização de proteínas quiméricas contendo fosfatases e módulo de ligação à celulose [Internet]. 2011 ;[citado 2024 set. 19 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-28032012-083445/
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