PEGuilação sítio-dirigida de uma L-asparaginase glicosilada de Erwinia chrysanthemi (2025)
- Authors:
- Autor USP: BRANDÃO, GUSTAVO HENRIQUE AZEVEDO - EP
- Unidade: EP
- Sigla do Departamento: PQI
- Subjects: BIOPROCESSOS; PROTEÍNAS RECOMBINANTES; ENGENHARIA QUÍMICA
- Agências de fomento:
- Language: Português
- Abstract: Atualmente, as formulações de L-asparaginase (ASNase) são produzidas a partir de espécies de bactérias e apresentam significativa resposta de hipersensibilidade e meia-vida curta para tratamentos de leucemia linfoblástica aguda. A pegaspargase (Oncaspar®) é uma ASNase PEGuilada que superou alguns dos problemas terapêuticos atribuídos à ASNase nativa, uma vez que a forma PEGuilada reduziu drasticamente a atividade imunogênica e aumentou o tempo de circulação na corrente sanguínea. O processo de PEGuilação é uma ferramenta importante para melhorar o perfil de qualidade dos biofármacos. Contudo, a Oncaspar® é obtida por reação de PEGuilação aleatória, produzindo variações lote-a-lote, o que são indesejáveis para controle de qualidade de produção de biofármaco. A crisantaspase (CRIS), ASNase de Dickeya chrysanthemi, é uma alternativa terapêutica promissora para pacientes refratários aos tratamentos com ASNase, sendo que previamente Pichia pastoris GlycoSwitch® foi utilizada como sistema de expressão para produzir uma crisantaspase com um padrão de glicosilação humanizada. Neste trabalho, as linhagens P. pastoris HIS+ e HIS- foram comparadas por meio de ferramentas estatísticas no que tange à eficiência na produção de biomassa, proteínas totais e enzima CRIS; para uma mesma concentração celular a linhagem P. pastoris HIS+ produziu um valor médio expressivamente maior. Assim, produzimos e purificamos a CRIS pelo cultivo de P. pastoris GlycoSwitch® e realizamos uma PEGuilação sítio dirigida na região N-terminal da enzima, com o objetivo de colaborar com o projeto temático Fapesp (Processo 13/08617-7) para produção nacional de uma ASNase com melhores propriedades físico-químicas, farmacocinéticas, termodinâmicas e biológicas. Em colaboração com esse projeto, esta tese objetiva também realizar osensaios termodinâmicos para avaliar os efeitos da PEGuilação na temperatura ótima e na termoinativação e desnaturação irreversível de proteoformas obtidas por meio de PEGuilação sítio dirigida N-terminal da CRIS com os derivados m-PEG-NHS (20 kDa) de cadeia linear e ramificado. A partir dos resultados desses ensaios termodinâmicos foi sugerido que a adição de quatro cadeias de PEG à enzima crisantaspase glicosilada contribuiu com o aumento da variação de entalpia de desnaturação (ΔH°u) e não prejudicou de forma expressiva a mobilidade conformacional. O processo de glicosilação diminuiu o acesso do PEG a região N-terminal, e por sua vez, o rendimento. Os resultados sugerem que o processo de glicosilação também aumentou a estabilidade CRIS-PEGLinear, em temperatura de refrigeração à 4°C. Em condições fisiológicas à 37°C uma maior densidade eletrônica conferida ao PEGRamificado preveniu flutuações conformacionais induzidas pelo calor. A viabilidade terapêutica da CRIS-PEGRamificada a torna promissora quando consideramos a possibilidade do desenvolvimento de uma formulação para melhorar a estabilidade em condições refrigeradas; assim, contribuiu para o desenvolvimento de L-asparaginases inovadoras com potencial de se tornarem biofármacos com produção nacional.
- Imprenta:
- Data da defesa: 01.10.2025
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ABNT
BRANDÃO, Gustavo Henrique Azevedo. PEGuilação sítio-dirigida de uma L-asparaginase glicosilada de Erwinia chrysanthemi. 2025. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2025. Disponível em: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/3/3137/tde-09012026-104711/pt-br.php. Acesso em: 27 jan. 2026. -
APA
Brandão, G. H. A. (2025). PEGuilação sítio-dirigida de uma L-asparaginase glicosilada de Erwinia chrysanthemi (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/3/3137/tde-09012026-104711/pt-br.php -
NLM
Brandão GHA. PEGuilação sítio-dirigida de uma L-asparaginase glicosilada de Erwinia chrysanthemi [Internet]. 2025 ;[citado 2026 jan. 27 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/3/3137/tde-09012026-104711/pt-br.php -
Vancouver
Brandão GHA. PEGuilação sítio-dirigida de uma L-asparaginase glicosilada de Erwinia chrysanthemi [Internet]. 2025 ;[citado 2026 jan. 27 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/3/3137/tde-09012026-104711/pt-br.php
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