Clonagem, expressão, purificação e caracterização bioquímica de enzimas fúngicas e humanas de interesse biotecnológico e medicinal (2024)
- Authors:
- Autor USP: SIMÕES, FLÁVIO ANTÔNIO DE OLIVEIRA - FCFRP
- Unidade: FCFRP
- Sigla do Departamento: 602
- DOI: 10.11606/T.60.2024.tde-10122024-125828
- Subjects: CLONAGEM; ENZIMAS; FUNGICIDAS; BIOTECNOLOGIA
- Keywords: Kinases; Komagataella phaffii; Komagataella phaffii; Peptidases; Quinases
- Agências de fomento:
- Language: Português
- Abstract: As enzimas são, na maioria das vezes, proteínas capazes de catalisar reações químicas. Elas possuem relevância biológica regulando processos bioquímicos que vão desde o metabolismo, a digestão e a transdução de sinais intracelulares. Sua diversidade funcional as tornam aplicáveis em diversas áreas, desde ambiental e médico até industrial. Entre as diversas classes de enzimas, as proteases se destacam pela capacidade de hidrolisar outras proteínas, e podem ser classificadas em diferentes grupos com base no principal aminoácido do seu sítio catalítico, como as serino, cisteíno e aspartil peptidases, por exemplo. Um outro grupo de grande relevância entre as enzimas, são as quinases. As quinases são capazes de fosforilar outras moléculas, modulando, por exemplo, vias de sinalização intracelular. Portanto, a compreensão das características bioquímicas das enzimas é fundamental para entender seu funcionamento, especificidade e estrutura. Nesta tese, realizamos a expressão, purificação e caracterização de enzimas fúngicas e humanas para determinar suas características bioquímicas. No Capítulo 1, descrevemos os protocolos de expressão e purificação de três peptidases (o domínio serino peptidase da TMPRSS2 (rTMPRSS_SP), uma citeíno e uma aspartil peptidases), utilizando Komagataella phaffii (anteriormente Pichia pastoris), o plasmídeopPICZαA e cauda de histidina. Para a rTMPRSS2_SP, descrevemos a influência de fatores físicos e químicos, como o pH e temperatura, íons metálicos, surfactantes, ditiotreitol (DTT), agentes caotrópicos e inibidores comerciais, sobre a atividade desta peptidase. Determinamos ainda os parâmetros cinéticos para dois novos substratos e a estabilidade da enzima para armazenamento. Para a rCist realizamos a expressão e purificação e estabelecemos condições para o ensaio enzimático. Por fim, realizamos a expressão e purificação da rAsp. No Capítulo 2, foram descritos protocolos de expressão em E. coli e purificação para duas construções contendo a Proteína Quinase B (AKT1) humana (AKT1-pET28a e AKT1-NanoLuciferase-TEV-pET28a). Foi determinado, através de NanoBret™ a influência da molécula SC79, ativadora da AKT1, sobre a farmacologia de três de seus inibidores. Os dados obtidos nesta tese são importantes para a determinação dos parâmetros bioquímicos de enzimas com diferentes aplicações
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2024
- Data da defesa: 26.03.2024
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- Cor do Acesso Aberto: gold
- Licença: cc-by-nc-sa
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ABNT
SIMÕES, Flávio Antônio de Oliveira. Clonagem, expressão, purificação e caracterização bioquímica de enzimas fúngicas e humanas de interesse biotecnológico e medicinal. 2024. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2024. Disponível em: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60137/tde-10122024-125828/. Acesso em: 01 dez. 2025. -
APA
Simões, F. A. de O. (2024). Clonagem, expressão, purificação e caracterização bioquímica de enzimas fúngicas e humanas de interesse biotecnológico e medicinal (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60137/tde-10122024-125828/ -
NLM
Simões FA de O. Clonagem, expressão, purificação e caracterização bioquímica de enzimas fúngicas e humanas de interesse biotecnológico e medicinal [Internet]. 2024 ;[citado 2025 dez. 01 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60137/tde-10122024-125828/ -
Vancouver
Simões FA de O. Clonagem, expressão, purificação e caracterização bioquímica de enzimas fúngicas e humanas de interesse biotecnológico e medicinal [Internet]. 2024 ;[citado 2025 dez. 01 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60137/tde-10122024-125828/
Informações sobre o DOI: 10.11606/T.60.2024.tde-10122024-125828 (Fonte: oaDOI API)
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