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Tese

Estudo dos efeitos do doador mitocondrial de sulfeto de hidrogênio (H2S) AP39 em células endoteliais humanas em cultura (2025)

  • Authors:
  • Autor USP: MARQUES, LEONARDO ANDRÉ DA COSTA - ICB
  • Unidade: ICB
  • Sigla do Departamento: BMF
  • DOI: 10.11606/T.42.2025.tde-02062025-104551
  • Subjects: FARMACOLOGIA; ÓXIDO NÍTRICO; MITOCÔNDRIAS; CÉLULAS ENDOTELIAIS; ENDOTÉLIO VASCULAR; PRESSÃO SANGUÍNEA; PROLIFERAÇÃO CELULAR
  • Keywords: Endotélio; Endothelium; Hydrogen Sulfide; Mitochondrion; Mitocôndria; Nitric Oxide; Óxido Nítrico; Sulfeto de Hidrogênio
  • Language: Português
  • Abstract: Introdução: o papel fisiológico do sulfeto de hidrogênio (H2S) no controle da pressão arterial e angiogênese denota a relevância dos compostos doadores de H2S como uma alternativa multifacetada e inovadora à disfunção endotelial. O doador de H2S direcionado às mitocôndrias, AP39, mostra efeitos antioxidantes e de vasorelaxamento in vitro e in vivo, inclusive descritos pelo nosso grupo. Entretanto, seus mecanismos intracelulares ainda não foram totalmente elucidados. Objetivos: os objetivos do presente estudo foram explorar os mecanismos de sinalização intracelular dos efeitos vasculares do AP39 sobre células endoteliais. Metodologia: células endoteliais derivadas de veia umbilical humana (HUVECs) foram tratadas com os doadores de H2S direcionados às mitocôndrias AP39 e RT-01, com suas porções doadoras ADT-OH e RT-02, respectivamente, com molécula controle destes compostos, AP219, ou com o sal de sulfeto NaHS, testando-se a viabilidade e dano celular. A expressão das enzimas produtoras de H2S (CSE, CBS e 3MST) nestas células foi avaliada por western blotting. A capacidade de produção de H2S, bem como a avaliação das concentrações de H2S no sobrenadante celular após diversos tratamentos com inibidores enzimáticos, doadores de H2S ou de óxido nítrico (NO) foram avaliadas pelo método de formação de PbS e por técnica fluorimétrica baseada na interação entre o H2S e o reagente monobromobimano. A proliferação e migração celular em resposta aos diferentes doadores de H2S foram avaliadas pelo ensaio de ferida biplanar scratch wound; a produção de NO e mecanismos relacionados foi avaliada pela sonda fluorescente diaminofluoriceína. Ainda, o estresse mitocondrial e glicolítico foram avaliados com ensaios desempenhados na plataforma Agilent Seahorse® XFe96.Resultados: nenhum efeito tóxico às células foi observado em concentrações inferiores à 1 mM. No entanto, o AP39 à 100 nM, mas não suas porções controle, aumentou a redução do MTT após tratamento por 48 h (129,05±7,35%, **P<0,01) comparado ao controle (100%). O tratamento de HUVECs com concentrações crescentes do doador de NO nitroprussiato de sódio (NPS) diminuiu as concentrações de sulfetos totais no sobrenadante celular em até 56,20±0,65% e 58,05±6,45% após 4 e 24 h, respectivamente (***P<0,001). Todas as três enzimas produtoras de H2S foram detectadas em homogenatos de HUVECs. A produção de H2S pelos homogenatos de HUVECs avaliada pela formação de PbS foi totalmente inibida pelo AOAA 1 mM e parcialmente inibida pelo PAG 1 mM (37,1±8,35%, **P<0,01). Ainda, os tratamentos dos homogenatos com NPS 10 mM e 30 mM aumentaram a produção de H2S destes (155,8±8,5% e 281,5±0,8%, respectivamente; ***P<0,001), ao passo que o tratamento com NaHS a inibiu de maneira concentração-dependente (até 54,3±4,15%, *P<0,05). A proliferação celular induzida pelo VEGF a 1 mg/mL (77,45±6,85%) foi inibida na presença do L-NAME 100 mM (11,40±2,5%, ***P<0,001), 1 mM PAG (51,05±1,25%, *P<0,05) e pela combinação de ambos (24,35±3,70%, *P<0,05). Por outro lado, apesar dos compostos AP39 e ADT-OH à 30 nM não induzirem proliferação, estes induziram a migração celular após o tratamento com estes (33,85±8,65%, *P<0,05 e 37,35±3,25%, **P<0,01, respectivamente) de HUVECs. No estudo da produção de NO por HUVECs, observouse que a produção de NO induzida pela bradicinina (11,0±0,6 UAs. 106) foi inibida após pré-incubação com PAG 1 mM (8,25±0,20 UAs.106; ***P<0,001) e AOAA 0,1 mM (6,1±0,1 UAs.106; ***P<0,001). Por outro lado, o tratamento com 10 e 30 mM de NaHS induziu a produção de H2S (8,15±0,4 e 8,30±0,45 UAs.106, respectivamente; ***P<0,001).Neste caso, observou-se redução significante da produção de H2S induzida por NaHS 10 mM após o tratamento com L-NAME 100 mM (4,90±0,30 UAs.106; ***P<0,001), triciribina 5 mM (6,10±0,45 UAs.106; ***P<0,001), LY-29002 5 mM (6,80±0,10 UAs.106; *P<0,05), AOAA 0,1 mM (7,70±0,25 UAs.106; **P<0,01), PAG 1 mM (5,95±0,30 UAs.106; **P<0,01), TEA 1 mM (4,30±0,45 UAs.106; ***P<0,001), apamina 5 mM (5,65±0,30 UAs.106; ***P<0,001) e 4-AP 2 mM (5,40±0,05 UAs.106; ***P<0,001). Ainda, ambos doadores de H2S direcionados às mitocôndrias (AP39 e RT- 01 a 100 nM), bem como suas porções doadoras (ADT-OH e RT-02, respectivamente) a 100 nM induziram a produção de NO (AP39 = 6,20±0,25 UAs.106; ***P<0,001; RT- 01 = 5,60±0,15 UAs.106; ***P<0,001; ADT-OH = 5,55±0,15 UAs.106; *P<0,05; RT-02 = 5,40±0,05 UAs.106; *P<0,05). Entretanto, os mecanismos para a produção de NO induzida pelo AP39 à 100 nM foram identificados após inibição da produção de NO pelo tratamento com L-NAME 100 mM (4,60±0,25 UAs.106; ***P<0,001), apamina 5 mM (5,65±0,1 UAs.106; *P<0,05), tapsigargina 1 mM (5,60±0,20 UAs.106; *P<0,05), rotenona 0,1 mM (4,90±0,25 UAs.106; ***P<0,001), antimicina 1 mM (4,85±0,25 UAs.106; ***P<0,001) e oligomicina 1 mM (4,60±0,10 UAs.106; ***P<0,001). Quanto aos atributos mitocondriais, a respiração mitocondrial máxima (0,80±0,05 pmol/min/mg; *P<0,05), capacidade máxima (0,40±0,05 pmol/min/mg; **P<0,01) e consumo não mitocondrial de oxigênio (0,80±0,05 pmol/min/mg; ***P<0,001) de HUVECs tratadas AP39 100 nM foi aumentada comparada ao controle.Ainda, quando tratadas nesta mesma concentração, tanto a glicólise (485,10±8,95 mpH/min/mg; **P<0,01), quanto a capacidade glicolítica (388,10±8,75 mpH/min/mg; **P<0,01) foram diminuídas comparado ao controle. Conclusões: a produção endógena de H2S pelas HUVECs foi associada principalmente à atividade de CSE e alguns pontos de interação foram identificados nas vias de produção de H2S e NO nestas células. No entanto, a proliferação, migração celular e produção de NO induzidas pelo AP39 são o destaque deste trabalho. Observou-se maior potência nos efeitos do AP39 comparada aos induzidos por NaHS, além de mecanismos diferenciados, destacando a suplementação de H2S às mitocôndrias e vias de produção de NO independentes das citosólicas associadas ao NaHS. Neste caso, os efeitos mitocondriais do AP39 favoreceram a respiração mitocondrial e reduziu a capacidade glicolítica, possivelmente sugerindo o papel do Ca2+ intracelular e produção de NO derivada. Estes mecanismos mitocondriais inovadores por parte do AP39 representam uma nova abordagem na terapêutica das doenças vasculares, dada pela suplementação à produção deficitária de H2S e NO, mas também na reversão da disfunção mitocondrial mais recentemente descrita nas doenças vasculares.
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 20.03.2025
    • Acesso à fonteAcesso à fonteDOI
    Informações sobre o DOI: 10.11606/T.42.2025.tde-02062025-104551 (Fonte: oaDOI API)
    • Este periódico é de acesso aberto
    • Este artigo é de acesso aberto
    • URL de acesso aberto
    • Cor do Acesso Aberto: gold
    • Licença: cc-by-nc-sa
    How to cite
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    • ABNT

      MARQUES, Leonardo André da Costa. Estudo dos efeitos do doador mitocondrial de sulfeto de hidrogênio (H2S) AP39 em células endoteliais humanas em cultura. 2025. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2025. Disponível em: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42136/tde-02062025-104551/. Acesso em: 28 dez. 2025.

    • APA

      Marques, L. A. da C. (2025). Estudo dos efeitos do doador mitocondrial de sulfeto de hidrogênio (H2S) AP39 em células endoteliais humanas em cultura (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42136/tde-02062025-104551/

    • NLM

      Marques LA da C. Estudo dos efeitos do doador mitocondrial de sulfeto de hidrogênio (H2S) AP39 em células endoteliais humanas em cultura [Internet]. 2025 ;[citado 2025 dez. 28 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42136/tde-02062025-104551/

    • Vancouver

      Marques LA da C. Estudo dos efeitos do doador mitocondrial de sulfeto de hidrogênio (H2S) AP39 em células endoteliais humanas em cultura [Internet]. 2025 ;[citado 2025 dez. 28 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42136/tde-02062025-104551/

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