Produção heteróloga em Escherichia coli BL21 (DE3) ΔasnA/ΔasnB de L-Asparaginase resistente a proteases plasmáticas (2024)
- Authors:
- Autor USP: LOPES, MARIA BEATRIZ NÓBREGA - FCF
- Unidade: FCF
- Sigla do Departamento: FBT
- DOI: 10.11606/D.9.2024.tde-20012025-155320
- Subjects: BIOPROCESSOS; ENZIMAS; ESCHERICHIA COLI; LEUCEMIA
- Keywords: Acute Lymphoblastic Leukemia; Downstream; Downstream; Escherichia coli; Escherichia coli; Extracellular L-Asparaginase; L-Asparaginase; L-Asparaginase; L-Asparaginase extracelular; Leucemia Linfoblástica Aguda; Protein purification; Purificação de proteínas
- Agências de fomento:
- Language: Português
- Abstract: A L-asparaginase tipo II de Escherichia coli é um agente terapêutico fundamental no tratamento da leucemia linfoblástica aguda. No entanto, a eficácia e o uso da L-Asparaginase têm sido limitados por frequentes reações de hipersensibilidade e pela formação de anticorpos anti-asparaginase, que neutralizam sua atividade enzimática. Assim, há uma busca pela produção viável de asparaginases alternativas com baixa toxicidade e alta eficácia. Este trabalho tem como objetivo a produção e purificação da enzima L-Asparaginase modificada EcAP40S/S206C, considerando a sua futura aplicação terapêutica. A produção da enzima foi realizada em modo descontínuo-alimentado em biorreator de bancada com 3 L de meio quimicamente definido e suplementado, à temperatura de 37ºC, com foco na expressão extracelular. A enzima foi produzida majoritariamente nas primeiras duas horas pós-indução, sendo posteriormente secretada para o meio extracelular, alcançando atividade enzimática de 62,9 U/mL. A enzima foi purificada até a homogeneidade a partir do sobrenadante do cultivo. Para isso, foi desenvolvido um processo de purificação que utiliza técnicas de filtração tangencial, cromatografia de troca aniônica e de exclusão molecular. A microfiltração teve o fluxo ótimo do permeado e área mínima de processo determinados em 12,3 LMH e 0,12 m², respectivamente. A diafiltração apresentou diferença significativa para recuperação da enzima com até 3 diavolumes.A pressão de transmembrana ideal para a ultrafiltração foi de 17 psi ou 1,2 bar. A maior capacidade dinâmica de adsorção entre as condições testadas para a cromatografia aniônica foi de 46 U/mLR, obtida com a resina Q Sepharose® XL e fase móvel Tris 20 mM NaCl 25 mM e pH 8. A EcAP40S/S206C foi conjugada com moléculas de polietilenoglicol mPEG-Mal de 20 kDa por reação sítio-específica em seu resíduo de cisteína adicionado por mutação e foi analisada quanto a sua atividade enzimática e estrutura. O processo resultou em uma L-Asparaginase mutante peguilada, com um rendimento final de 6% e atividade específica determinada por método de Nessler de 90,9 ± 4,1 U/mg. O espectro de dicroísmo circular indicou que a enzima manteve a sua estrutura secundária estável após a reação de peguilação, e a análise por espalhamento dinâmico de luz demonstrou a homogeneidade da amostra alcançada com este processo, revelando a presença de menos de 2% de agregados e índice de polidispersão igual a 0,189. Este trabalho contribui para o desenvolvimento de uma L-Asparaginase nacional, com potencial uso no tratamento da leucemia linfoblástica aguda, reduzindo a dependência do mercado externo
- Imprenta:
- Data da defesa: 05.11.2024
- Este periódico é de acesso aberto
- Este artigo NÃO é de acesso aberto
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ABNT
LOPES, Maria Beatriz Nóbrega. Produção heteróloga em Escherichia coli BL21 (DE3) ΔasnA/ΔasnB de L-Asparaginase resistente a proteases plasmáticas. 2024. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2024. Disponível em: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-20012025-155320/. Acesso em: 10 fev. 2026. -
APA
Lopes, M. B. N. (2024). Produção heteróloga em Escherichia coli BL21 (DE3) ΔasnA/ΔasnB de L-Asparaginase resistente a proteases plasmáticas (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-20012025-155320/ -
NLM
Lopes MBN. Produção heteróloga em Escherichia coli BL21 (DE3) ΔasnA/ΔasnB de L-Asparaginase resistente a proteases plasmáticas [Internet]. 2024 ;[citado 2026 fev. 10 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-20012025-155320/ -
Vancouver
Lopes MBN. Produção heteróloga em Escherichia coli BL21 (DE3) ΔasnA/ΔasnB de L-Asparaginase resistente a proteases plasmáticas [Internet]. 2024 ;[citado 2026 fev. 10 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-20012025-155320/
Informações sobre o DOI: 10.11606/D.9.2024.tde-20012025-155320 (Fonte: oaDOI API)
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