Construção de ferramentas moleculares para estudo in vitro da função do receptor de succinato (GPR91) (2024)
- Authors:
- Autor USP: SANTOS, ANDRESSA MAYARA DOS - FMRP
- Unidade: FMRP
- DOI: 10.11606/D.17.2024.tde-26092024-135000
- Subjects: RECEPTORES; HOMEOSTASE; ESTRESSE; DOR; MEDICALIZAÇÃO
- Keywords: BRET; BRET; Dor; GPCR; GPCR; GPR91; GPR91; Pain; Succinate; Succinato; TANGO; TANGO
- Agências de fomento:
- Language: Português
- Abstract: O succinato, intermediário do Ciclo de Krebs, está envolvido em diversas rotas metabólicas e é um importante componente para a regulação da homeostase energética. Seu receptor - GPR91 (Sucnr1) - desempenha papel fundamental na detecção de desbalanços causados por estresse local, neste contexto, resultados preliminares do nosso grupo demonstraram que injeções de succinato e consequente ativação do receptor GPR91 em camundongos wild-type contribuíram para o desenvolvimento de hipersensibilidade mecânica (alodinia). Com esse background, visamos desenvolver uma ferramenta in vitro baseada na técnica TANGO (ativação transcricional mediante translocação de beta arrestina) e BRET (transferência de energia de ressonância de bioluminescência) para o estudo funcional de GPR91. Para a realização de experimentos por BRET, inserimos o fragmento do receptor GPR91 associado ao fator de transcrição tTA no vetor pcDNA3.1/Hygro(+)-GFP10-RLucII a fim de associar a luciferase RLucII a porção c-terminal do receptor. Após validação da inserção, GPR91-RLucII e GFP-NLS foram transfectados em diferentes concentrações a fim de encontrar as condições ideais para realização dos experimentos de BRET. Outra abordagem, seria induzir a expressão estável do receptor GPR91-TANGO em células HTLA utilizando duas estratégias: o kit Kit Flp-In T-Rex (Invitrogen) e a transdução lentiviral. Em relação a abordagem por lentivírus, inicialmente tentamos realizar a clonagem do inserto GPR91-TANGO no vetor lentiCas9-EGFP. Entretanto, possivelmente devido a estratégia de clonagem e/ou inserção de eventuais mutações no backbone, não obtivemos sucesso na produção de partículas virais. Um vetor Lenti GPR91-TANGO já clonado com nosso receptor de interesse foi encomendado, transfectado em células HEK Phoenix para produção de partículas virais e posteriormente transduzido em células HTLA. As células com marcação positiva para a proteínafluorescente GFP se encontram em processo de isolamento e expansão clonal. A partir das técnicas propostas no presente projeto esperamos disponibilizar novas ferramentas e realizar screening em larga escala de moléculas moduladoras do receptor GPR91 com potencial terapêutico de modo rápido e eficaz
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2024
- Data da defesa: 21.06.2024
- Este periódico é de acesso aberto
- Este artigo é de acesso aberto
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- Cor do Acesso Aberto: gold
- Licença: cc-by-nc-sa
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ABNT
SANTOS, Andressa Mayara dos. Construção de ferramentas moleculares para estudo in vitro da função do receptor de succinato (GPR91). 2024. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2024. Disponível em: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17133/tde-26092024-135000/. Acesso em: 28 dez. 2025. -
APA
Santos, A. M. dos. (2024). Construção de ferramentas moleculares para estudo in vitro da função do receptor de succinato (GPR91) (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17133/tde-26092024-135000/ -
NLM
Santos AM dos. Construção de ferramentas moleculares para estudo in vitro da função do receptor de succinato (GPR91) [Internet]. 2024 ;[citado 2025 dez. 28 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17133/tde-26092024-135000/ -
Vancouver
Santos AM dos. Construção de ferramentas moleculares para estudo in vitro da função do receptor de succinato (GPR91) [Internet]. 2024 ;[citado 2025 dez. 28 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17133/tde-26092024-135000/
Informações sobre o DOI: 10.11606/D.17.2024.tde-26092024-135000 (Fonte: oaDOI API)
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