Geração de uma linhagem celular humana com produção permanente da enzima lisossomal β-glicosilceramidase recombinante por meio do sistema lentiviral (2018)
- Authors:
- Autor USP: CARDOSO, JÉSSICA LUANA SOUZA - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RGE
- DOI: 10.11606/D.17.2018.tde-05082024-093034
- Subjects: DOENÇAS GENÉTICAS; LISOSSOMOS; LINHAGEM CELULAR; PROTEÍNAS RECOMBINANTES; LENTIVIRUS; GENÉTICA
- Keywords: Doença de Gaucher; Gaucher disease; Glicosilceramidase recombinante; Human cell line; Lentiviral system; Linhagem celular humana; Proteína recombinante GFP (green fluorescente protein); Recombinant glucosylceramidase; Recombinant green fluorescent protein (GFP); Sistema lentiviral
- Agências de fomento:
- Language: Português
- Abstract: A doença de Gaucher (DG) é uma doença de acúmulo lisossomal, com padrão de herança autossômico recessivo, devido a mutação no gene que codifica a enzima β-glicosilceramidase ácida (GBA), que hidrolisa o esfingolipídeo glicosilceramida. Atualmente, o tratamento mais utilizado para a DG é a Terapia de Reposição Enzimática (TRE), que faz uso de infusões de GBA recombinante para elevar o catabolismo da glicosilceramida. Entre as diferentes estratégias para produção de GBA recombinante o uso do sistema lentiviral é pouco explorado. Nesse sentido, esse trabalho visa a geração de uma linhagem celular humana com produção estável da enzima β-glicosilceramidase recombinante utilizando o sistema lentiviral. Como controle, foram geradas linhagens celulares humanas com expressão estável da proteina recombinante GFP (green fluorescent protein) para avaliar a eficiência da transdução por meio de diferentes quantidades virais. Primeiramente foram produzidas partículas lentivirais por meio da transfecção dos respectivos plasmídeos na linhagem celular 293-FT. A análise do título viral das partículas lentivirais portadoras dos cDNAs codificantes para GFP e GBA revelou níveis da ordem de 7,9 x 106 e 4,3 x 107 unidades transducionais/ mL de sobrenadante, respectivamente. Em seguida foram geradas duas linhagens celulares humanas com produção estável de GFP: 1) L22_293-FT_GFP_M1 transduzida com MOI igual a 1,0 e um ciclo de transdução e que mostrou apresentar 67% de células positivas para GFP e 2) L22_293-FT_GFP_M10 transduzida com MOI igual a 10 e três ciclos de transdução e que mostrou apresentar 94% de células positivas para GFP. Esses dados sugerem que houve diferença no nível de expressão conforme o MOI utilizado e o número de ciclos de transdução. Com base nessas informações, foi gerada uma terceira linhagem celular humana nomeada L20_293-FT_GBA_Mut-1 comMOI igual a 15 e produção estável da enzima GBA recombinante. Após a seleção da linhagem celular L20_293-FT_GBA_Mut-1 com puromicina, a molécula GBA_Mut-1 foi caracterizada pelo ensaio de fluorimetria para avaliação da atividade biológica da enzima recombinante. O nível da atividade biológica da enzima GBA_Mut-1 presente no sobrenadante foi 34,19 + 4,74 U GBA/mL e a atividade específica foi 231,8 + 51,62 U GBA/mg de proteína. Por fim, foi avaliada a produtividade da linhagem celular L20_293-FT_GBA_Mut-1 que mostrou níveis de secreção de 38,74 + 4,8 U/ 106 células e de produção intracelular de 119,1 + 34,71 U GBA/ 106 células. Em conclusão, esse trabalho mostrou a eficácia do sistema lentiviral em manter a expressão estável e duradoura da enzima lisossomal recombinante e sugere a tecnologia para geração de linhagens celulares humanas transgênicas produtoras de enzima lisossomal no sobrenadante e intracelular
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2018
- Data da defesa: 28.06.2018
- Este periódico é de acesso aberto
- Este artigo é de acesso aberto
- URL de acesso aberto
- Cor do Acesso Aberto: gold
- Licença: cc-by-nc-sa
-
ABNT
CARDOSO, Jéssica Luana Souza. Geração de uma linhagem celular humana com produção permanente da enzima lisossomal β-glicosilceramidase recombinante por meio do sistema lentiviral. 2018. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2018. Disponível em: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-05082024-093034/. Acesso em: 05 jan. 2026. -
APA
Cardoso, J. L. S. (2018). Geração de uma linhagem celular humana com produção permanente da enzima lisossomal β-glicosilceramidase recombinante por meio do sistema lentiviral (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-05082024-093034/ -
NLM
Cardoso JLS. Geração de uma linhagem celular humana com produção permanente da enzima lisossomal β-glicosilceramidase recombinante por meio do sistema lentiviral [Internet]. 2018 ;[citado 2026 jan. 05 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-05082024-093034/ -
Vancouver
Cardoso JLS. Geração de uma linhagem celular humana com produção permanente da enzima lisossomal β-glicosilceramidase recombinante por meio do sistema lentiviral [Internet]. 2018 ;[citado 2026 jan. 05 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-05082024-093034/
Informações sobre o DOI: 10.11606/D.17.2018.tde-05082024-093034 (Fonte: oaDOI API)
How to cite
A citação é gerada automaticamente e pode não estar totalmente de acordo com as normas
