Aplicação da tecnologia portátil de sequenciamento MinION para análise do metagenoma viral (2023)
- Authors:
- Autor USP: ZUCHERATO, VICTORIA SIMIONATTO - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RCM
- DOI: 10.11606/D.17.2023.tde-16102023-115348
- Subjects: SEQUENCIAMENTO GENÉTICO; GENOMAS; VÍRUS; TECNOLOGIAS DA SAÚDE
- Keywords: Metagenômica; Metagenomics; Nanopores; Nanoporos; Optimization; Padronização; Pré-processamento; Pre-processing; Viruses
- Agências de fomento:
- Language: Português
- Abstract: As tecnologias de Sequenciamento de Nova Geração (SNG) mostraram um crescimento acelerado nos últimos anos. Uma das principais aplicações do SNG é a metagenômica, que identifica patógenos emergentes para os quais não há diagnóstico estabelecido. Uma técnica promissora e de custo relativamente baixo é a tecnologia portátil MinION. Um dos maiores problemas da plataforma MinION é a falta de protocolos otimizados (pré-preparo da amostra, concentração viral, extração e amplificação). Portanto, o objetivo desse trabalho é padronizar e otimizar os procedimentos de metagenômica viral aplicados ao sequenciamento de nanoporos. O controle do sequenciamento foi realizado utilizando vírus RNA (bolsa de sangue positiva para HIV, cycle threshold - Ct=25,8) e vírus DNA (citomegalovírus humano cultivado). Estes controles foram utilizados para padronizar os processos de concentração viral, extração e preparo de bibliotecas metagenômicas. Inicialmente, após a degradação enzimática do material do hospedeiro, foi realizada a concentração viral por ultracentrifugação, que foi consequentemente confirmada com microscopia eletrônica de transmissão. Além disso, foi realizada a concentração viral por método químico utilizando poliacrilamida linear. As amostras concentradas foram extraídas com dois kits diferentes a fim de comparação: QIAamp UltraSens Virus (QIAGEN) e High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume (Roche Life Science). Em seguida, comparamos diferentes métodos de fragmentação do DNA: fragmentação mecânica (Covaris), fragmentação química (endonucleases), amplificação pelo sistema de primer SMART-9N e amplificação isotérmica sem ligação dos fragmentos. Todas as amostras foram sequenciadas utilizando a flow cell 9.4.1 no dispositivo MinION. Na microscopia eletrônica de transmissão visualizamos várias partículas de HIV (tamanho esperado 80-100 nm)bem como uma abundância de fagos, que mostrou a importância da concentração viral. Em seguida, a análise bioinformática revelou que as amostras concentradas por LPA, extraídas pelo kit QIAamp UltraSens Virus e amplificadas pelo método SMART-9N apresentaram maior abundancia viral e número elevado de leituras dos vírus tidos como controles (HIV e CMV). Portanto, propusemos que a metagenômica por sequenciamento de nanoporos seja feita utilizando esses métodos e concluímos que a padronização de todos os procedimentos de pré-processamento de amostras é crucial para melhores resultados de sequenciamento utilizando a tecnologia MinION, que permitirá sua aplicação na área de metagenômica viral e na descoberta de patógenos virais desconhecidos ou reemergentes
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2023
- Data da defesa: 06.06.2023
- Status:
- Artigo publicado em periódico de acesso aberto (Gold Open Access)
- Versão do Documento:
- Versão publicada (Published version)
- Acessar versão aberta:
-
ABNT
ZUCHERATO, Victoria Simionatto. Aplicação da tecnologia portátil de sequenciamento MinION para análise do metagenoma viral. 2023. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2023. Disponível em: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17153/tde-16102023-115348/. Acesso em: 01 abr. 2026. -
APA
Zucherato, V. S. (2023). Aplicação da tecnologia portátil de sequenciamento MinION para análise do metagenoma viral (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de https://teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17153/tde-16102023-115348/ -
NLM
Zucherato VS. Aplicação da tecnologia portátil de sequenciamento MinION para análise do metagenoma viral [Internet]. 2023 ;[citado 2026 abr. 01 ] Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17153/tde-16102023-115348/ -
Vancouver
Zucherato VS. Aplicação da tecnologia portátil de sequenciamento MinION para análise do metagenoma viral [Internet]. 2023 ;[citado 2026 abr. 01 ] Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17153/tde-16102023-115348/ - Seleção de genes de referência para células-tronco mesenquimais endometriais de fluxo menstrual em endometriose
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