Mapeamento de regiões cromossômicas com alto potencial de expressão gênica como alvo para seu uso na produção de proteínas recombinantes (2020)
- Authors:
- Autor USP: POMATAY, LUIS ALBERTO QUISPE - Interunidades em Biotecnologia
- Unidade: Interunidades em Biotecnologia
- Subjects: BIOTECNOLOGIA; LINHAGEM CELULAR; BIOFARMACOLOGIA; MAPEAMENTO CROMOSSÔMICO; PROTEÍNAS RECOMBINANTES; EXPRESSÃO GÊNICA; INDÚSTRIA FARMACÊUTICA
- Keywords: Biofármacos; Biopharmaceutical; CHO; CHO; inserção sítio-dirigida; lentiviral vector; site-directed insertion; vetores lentivirais
- Language: Português
- Abstract: Nas últimas décadas, observou-se uma melhoria de várias etapas do processo de fabricação de produtos biofarmacêuticos, que acabaram se traduzindo em aumento da capacidade de produção do setor. No entanto, a produção de produtos biofarmacêuticos envolve processos complexos e de baixo rendimento. Entre os principais fatores limitantes relacionados ao estabelecimento de uma plataforma de produção baseada em células de mamíferos estão o tempo prolongado e altos custos associados ao processo de obtenção de clones celulares de alta produtividade. Essas limitações estão intimamente relacionadas às metodologias comumente empregadas para a geração de transfectantes celulares estáveis, que envolvem eventos aleatórios de integração genômica de vetores de expressão, e o uso de protocolos de amplificação gênica, que estão associados, respectivamente, a eventos de inserção em sítios cromossômicos com atividade transcricional instável e reordenamentos genéticos drásticos. Uma alternativa que tem sido explorada nos últimos anos é baseada na inserção sítio-dirigida do cassete de expressão de interesse em regiões do genoma da célula hospedeira previamente associadas à uma atividade transcricional elevada e estável. A indústria biofarmacêutica tem mostrado um crescente interesse por este tipo de alternativa para a geração de clones superprodutores em células CHO, uma das plataformas de expressão mais utilizadas para a produção de biofármacos.Nesse sentido, existe uma demanda para se acumular conhecimento sobre regiões genômicas que suportam níveis estáveis e elevados de expressão gênica, e o objetivo principal deste trabalho consistiu na varredura desses “hotspots” genômicos na linhagem celular CHO-DG44. Nossa estratégia experimental envolveu: a) a construção e o uso de um vetor lentiviral bicistrônico de expressão, o pLV-spEYFP-DHFR, para a varredura de sítios genômicos em células CHO-DG44 associadas a uma expressão elevada e estável da proteína de interesse, e b) o uso de uma variante secretada da EYFP, a spEYFP, como proteína repórter, com o intuito de evitar um possível efeito deletério associado ao acúmulo citoplasmático da EYFP. Alternativamente, as células CHO-DG44 foram transfectadas com o mesmo vetor de expressão com o objetivo de se isolar clones celulares para servir como referência de níveis de expressão da spEYFP associados a números mais elevados de cópias genômicas do vetor de expressão. Explorando-se a transdução das células CHO-DG44 com o vetor pLV-spEYFP-DHFR, foram isolados e caracterizados oito clones celulares associados a eventos de integração genômica únicos do vetor de expressão. Estes clones celulares apresentaram níveis de expressão estáveis da proteína repórter por até dois meses, e comparáveis aos observados em clones celulares contendo de 35 a 45 cópias do mesmo vetor de expressão aleatoriamente integrado no genoma das células CHO-DG44.As nossas tentativas de mapeamento dos sítios genômicos de inserção através da técnica de DNA “walking” foram dificultadas por várias limitações associadas a fatores que limitaram a sensibilidade da técnica em detectar eventos únicos de inserção. Este trabalho foi a primeira tentativa de mapear sítios genômicos transcricionalmente ativos e estáveis em células CHO-DG44, e buscou, desta forma, complementar os achados envolvendo outras linagens de células CHO importantes, a CHO-K1 e a CHO-S
- Imprenta:
- Data da defesa: 28.01.2020
-
ABNT
POMATAY, Luis Alberto Quispe. Mapeamento de regiões cromossômicas com alto potencial de expressão gênica como alvo para seu uso na produção de proteínas recombinantes. 2020. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2020. Disponível em: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-21092023-085334/. Acesso em: 26 jan. 2026. -
APA
Pomatay, L. A. Q. (2020). Mapeamento de regiões cromossômicas com alto potencial de expressão gênica como alvo para seu uso na produção de proteínas recombinantes (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-21092023-085334/ -
NLM
Pomatay LAQ. Mapeamento de regiões cromossômicas com alto potencial de expressão gênica como alvo para seu uso na produção de proteínas recombinantes [Internet]. 2020 ;[citado 2026 jan. 26 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-21092023-085334/ -
Vancouver
Pomatay LAQ. Mapeamento de regiões cromossômicas com alto potencial de expressão gênica como alvo para seu uso na produção de proteínas recombinantes [Internet]. 2020 ;[citado 2026 jan. 26 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-21092023-085334/
How to cite
A citação é gerada automaticamente e pode não estar totalmente de acordo com as normas
