Enterococcus faecalis: Cluster epa (2023)
- Authors:
- Autor USP: CLEMENTINO, LÍVIA OLIVEIRA DANTAS - IFSC
- Unidade: IFSC
- Sigla do Departamento: FCI
- DOI: 10.11606/T.76.2023.tde-17082023-114630
- Subjects: RESISTÊNCIA MICROBIANA ÀS DROGAS; ENTEROCOCCUS; ENZIMAS; CRISTALOGRAFIA ESTRUTURAL; BIOLOGIA MOLECULAR
- Keywords: Cluster epa; Enterococcus faecalis; Bacterial resistance; Biologia estrutural; Resistência bacteriana a antibióticos; Structural biology
- Agências de fomento:
- Language: Português
- Abstract: A resistência bacteriana a antibióticos é um problema de saúde pública, com tendência a se agravar ao longo do tempo. A consequência disto é refletida na quantidade de mortes provocadas por infecções de tais microrganismos, estimada em 7.7 milhões em 2019, número com tendência a aumentar. Neste contexto, iniciou-se o estudo de quatro enzimas presentes no cluster gênico epa. As proteínas Epa sintetizam e exportam carboidratos constituintes da parede celular de Enterococcus, envolvidos também na composição de biofilmes. Realizaram-se clonagem, expressão heteróloga e purificação com as enzimas EpaI, EpaOX, EpaB e EpaE de Enterococcus faecalis DSM20478. Apesar de diferentes estratégias aplicadas para otimizar a expressão e purificação dessas proteínas, a EpaE foi a única a apresentar rendimento e estabilidade razoáveis para ser submetida a uma triagem envolvendo múltiplas condições de cristalização. Um conjunto de dados foi coletado na linha Manacá do anel síncrotron brasileiro, o Sirius. O grupo espacial do cristal é o P21, apresentando fração de twinning pseudomeroedral. A estrutura refinada da EpaE foi determinada a 2.85 Å. Ela tem conformação tetramérica na unidade assimétrica, com um enovelamento do tipo Rossman. Análises realizadas pelo servidor PDBePISA indicaram que as interfaces formadas pelas cadeias A e B, e C e D são mais estáveis do que a B e C, e A e D, sugerindo se tratar de um dímero de dímeros. O sítio catalítico da EpaE foi identificado a partir dasobreposição estrutural com outra RmlA de maior resolução. Durante o refinamento da EpaE, foi percebida a presença de uma densidade eletrônica correspondente a molécula de timidina, presente no provável sítio alostérico da EpaE. O protocolo estabelecido para medir a atividade de RmlAs foi aplicado, ele detecta fosfato em solução a partir do reagente verde de malaquita. Entretanto, foi observado que o reagente verde de malaquita não é uma boa solução colorimétrica por não possuir intensidade das curvas de absorbância proporcional à concentração de fosfato no meio. Para sanar este problema, a técnica de detecção de fosfato com azul de molibdênio foi testada na medida da atividade específica da EpaE. Por fim, o programa AlphaFold2 realizou predição das demais enzimas presentes no cluster epa, possibilitando elucidação de algumas funções dessas enzimas na síntese e transporte do antígeno polissacarídeo enterocócico de E. faecalis. Neste trabalho, determinamos a primeira estrutura cristalográfica de uma enzima do cluster epa e avançamos na identificação de um potencial inibidor da enzima EpaE
- Imprenta:
- Publisher place: São Carlos
- Date published: 2023
- Data da defesa: 19.05.2023
- Status:
- Artigo publicado em periódico de acesso aberto (Gold Open Access)
- Versão do Documento:
- Versão publicada (Published version)
- Acessar versão aberta:
-
ABNT
CLEMENTINO, Lívia Oliveira Dantas. Enterococcus faecalis: Cluster epa. 2023. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Carlos, 2023. Disponível em: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76133/tde-17082023-114630/. Acesso em: 09 maio 2026. -
APA
Clementino, L. O. D. (2023). Enterococcus faecalis: Cluster epa (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Carlos. Recuperado de https://teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76133/tde-17082023-114630/ -
NLM
Clementino LOD. Enterococcus faecalis: Cluster epa [Internet]. 2023 ;[citado 2026 maio 09 ] Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76133/tde-17082023-114630/ -
Vancouver
Clementino LOD. Enterococcus faecalis: Cluster epa [Internet]. 2023 ;[citado 2026 maio 09 ] Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76133/tde-17082023-114630/ - Estudos estruturais de glicosiltransferases envolvidas na síntese de biofilmes em Enterococcus faecalis
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