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Tese

Estudo das relações funcionais entre proteínas O-gluconaciladas e a sinalização do receptor de angiotensina II do tipo 1 (2023)

  • Authors:
  • Autor USP: SILVA NETO, JULIO ALVES DA - FMRP
  • Unidade: FMRP
  • Sigla do Departamento: RFA
  • DOI: 10.11606/T.17.2023.tde-29062023-112915
  • Subjects: PROTEÍNAS; GLUCAGON; RECEPTORES; ANGIOTENSINAS
  • Keywords: db/db; GPCR; HEK293T; O-GlcNAc; Receptor AT1
  • Agências de fomento:
  • Language: Português
  • Abstract: Os receptores de sete domínios de membrana (GPCR) são proteínas que, ao serem ativadas por hormônios, neurotransmissores ou fármacos, disparam vias de sinalização intracelular pela ativação de proteínas G, de quinases e da beta-arrestina. O receptor de angiotensina II do tipo I (AT1R) é um GPCR que representa importante alvo terapêutico para o controle da hipertensão arterial e outras condições de risco cardiovascular. Quando ativado pela angiotensina II (Ang II), produz aumento no tônus arterial, liberação de neurotransmissores e reabsorção renal de sódio para a regulação do meio interno. A O-gluconacilação (O-GlcNAc) é uma modificação pós-traducional que ocorre em proteínas intracelulares, e que está aumentada em distúrbios metabólicos como o diabetes e a hipertensão. Esta modificação ocorre pela anexação enzimática de uma molécula de N-acetil glucosamina endógena a proteínas intracelulares, gerando mudanças na funcionalidade de proteínas responsáveis por regular a fisiologia de vasos sanguíneos e outros órgãos. Considerando estes dois problemas fisiológicos, o objetivo deste trabalho foi investigar, a partir do perfil de sinalização do AT1R em sistemas biológicos com aumento global de proteínas O-gluconaciladas, a hipótese que o aumento de O-GlcNAc altera a sinalização do AT1R, reduzindo o recrutamento de beta-arrestina, e sustentando por mais tempo os efeitos pró-contráteis e deletérios da Ang II. A hipótese foi avaliada por duas frentes de investigação: inicialmente foram cultivadas células HEK293T expressando estavelmente o AT1R humano. As células foram submetidas a aumento global de proteínas O-gluconaciladas usando o inibidor enzimático thiamet G (TMG 1 µM por 16 horas). Em seguida, o AT1R foi ativado por Ang II, agonista endógeno, ou pelo TRV027, agonista tendencioso para a via da beta-arrestina. Foram quantificadas apotência (pEC50) e a eficácia (Rmax) destes agonistas para a fosforilação de quinases, mobilização de cálcio, recrutamento de beta-arrestina e internalização do receptor. Também foi aferida a densidade de AT1R na membrana. Posteriormente foram feitos experimentos usando artérias mesentéricas isoladas de camundongos espontaneamente diabéticos [C57BLKS/6JLepR-/-(+)]; um modelo nativo de expressão de AT1R e de aumento de proteínas O-gluconaciladas, para se relacionar os achados em células com a disfunção vascular associada ao diabetes. Nestas artérias, o AT1R também foi ativado por Ang II e TRV027 e se mediu, além da pEC50 e Rmax de contração, a taxa de taquifilaxia, o recrutamento de beta-arrestina e o tempo de dessensibilização. Nestas artérias isoladas, foram empregados inibidores das quinases PKC (proteína quinase C, RO 31-8220, 1 µM) e MEK [que induz fosforilação e ativação de ERK 1/2 (quinase regulada por sinal extracelular), PD98059, 10 µM], e o quelante de cálcio citoplasmático BAPTA-AM (10 µM). Nas células HEK293T tratadas com TMG houve aumento persistente de proteínas modificadas por O-GlcNAc e, ao se ativar o AT1R, houve aumento na fosforilação de ERK1/2 e dos transientes de cálcio pelo aumento de O-Gluconacilação. Não houve diferença na densidade ou na taxa de internalização do AT1R, nem no recrutamento de beta-arrestina ou ativação de PKC por ação do TMG. Nos experimentos funcionais em artérias isoladas, a resposta contrátil para Ang II foi maior nos animais db/db, comparando-se às artérias dos camundongos heterozigotos db/+. O estímulo para recrutar beta-arrestina (TRV027) reduziu de maneira igual a eficácia da Ang II em artérias dos dois fenótipos de camundongos. A perda de resposta por taquifilaxia foi igual para artérias dos dois animais. A taxa de dessensibilização do AT1R foi maior nas artérias de db/db se comparadasàquela em artérias de db/+. Um outro conjunto de experimentos usando inibidores de quinases foi conduzido para se aferir a participação da ERK 1/2 e da PKC no aumento de contratilidade. Por último, se investigou a contribuição do cálcio intracelular no aumento de eficácia da Ang II nas artérias mesentéricas usando BAPTA. A contratilidade vascular em animais db/db desta vez foi menor que nas preparações não tratadas. Tendo em mãos estes dados, conclui-se que o aumento da eficácia da Ang II diante de elevado conteúdo de O-GlcNAc intracelular ocorre em razão de uma maior biodisponibilidade de íons cálcio como mensageiro secundário e não por uma atuação reduzida da beta-arrestina sobre o receptor
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 28.04.2023
    • Acesso à fonteAcesso à fonteDOI

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    Status:
    Artigo publicado em periódico de acesso aberto (Gold Open Access)
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    Versão publicada (Published version)
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    • ABNT

      SILVA NETO, Júlio Alves da. Estudo das relações funcionais entre proteínas O-gluconaciladas e a sinalização do receptor de angiotensina II do tipo 1. 2023. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2023. Disponível em: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17133/tde-29062023-112915/. Acesso em: 09 abr. 2026.

    • APA

      Silva Neto, J. A. da. (2023). Estudo das relações funcionais entre proteínas O-gluconaciladas e a sinalização do receptor de angiotensina II do tipo 1 (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de https://teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17133/tde-29062023-112915/

    • NLM

      Silva Neto JA da. Estudo das relações funcionais entre proteínas O-gluconaciladas e a sinalização do receptor de angiotensina II do tipo 1 [Internet]. 2023 ;[citado 2026 abr. 09 ] Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17133/tde-29062023-112915/

    • Vancouver

      Silva Neto JA da. Estudo das relações funcionais entre proteínas O-gluconaciladas e a sinalização do receptor de angiotensina II do tipo 1 [Internet]. 2023 ;[citado 2026 abr. 09 ] Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17133/tde-29062023-112915/

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