Estudo da via de transporte de água e ou amônia através dos transportadores de ureia (UTs) quando expressos em oócitos da rã Lithobates catesbeianus (2021)
- Authors:
- Autor USP: LOPES, NEYDIANA BELIZE DE PINA - ICB
- Unidade: ICB
- Sigla do Departamento: BMB
- DOI: 10.11606/D.42.2021.tde-14012022-235156
- Subjects: UREIA; OÓCITOS; AMÔNIA; RÃ; ANTICORPOS MONOCLONAIS; CAMUNDONGOS; WESTERN BLOTTING; RIM
- Keywords: Lithobates oocytes; ammonia transport; medidas do pH de superfície; oócitos de Lithobates; surface pH; Transportadores de ureia; transporte de água; transporte de amônia; transporte de ureia; urea transport; Urea transporters; water transport
- Language: Português
- Abstract: Nos rins, os transportadores de ureia (UTs) são responsáveis por facilitar o transporte de ureia, contribuindo para manter um interstício medular altamente concentrado, importante para os mecanismos de concentração urinária. Os mamíferos possuem dois genes, SLC14A1, que codifica UT-B, e SLC14A2, que gera variantes por splice, UT-A1, A2 e A3. Nos rins, UT-A1 é expresso na membrana apical e UT-A3 na membrana basolateral do ducto coletor medular interno; UT-A2 é expresso no segmento descendente fino da alça de Henle e UT-B nos vasos retos descendentes. A estrutura cristalina do UT-B de bovino (b) revela que o UT é uma proteína homotrimérica e cada monômero funciona como um canal para o transporte de ureia. No centro de cada monômero há um filtro de seletividade que coordena o transporte de ureia a favor do seu gradiente de concentração. Na região mais estreita desse filtro foram identificados dois resíduos de Treonina (Thr ou T) T172 e T334 que formam o sítio de ligação da proteína com a ureia e são conservados em todas as isoformas UT. Dois Trabalhos anteriores demostraram que o UT-B, expresso em níveis elevados em oócitos de Xenopus laevis, não apenas transporta ureia, mas também funciona como um canal para água (YANG; VERKMAN, 1998; GEYER et. al., 2013) e NH3 (GEYER et. al., 2013). Recentemente, nosso laboratório confirmou que UT-B funciona como um canal para água e, demonstrou pela primeira vez que UT-A2 e UT-A3 também são capazes de transportar água, além de ureia.Quando expressos em oócitos da rã Lithobates catesbeianus, um sistema de expressão heteróloga de proteínas padronizado em nosso laboratório. Nesse estudo, nós investigamos o efeito do inibidor Floretina e da mutação dos dois resíduos conservados de T por V no transporte de ureia, água e NH3 através das proteínas de camundongo (m) mUT-A2, mUT-A3 e mUT-B. Oócitos de Lithobates foram injetados com cRNA para a expressão de UTs WT versus mutantes [(UT-A2^[WT] vs UT-A2^[T176V] e UT-A2^[T338V]), (UT-A3^[WT] vs UT-A3^[T246V] e UT-A3^[T408V]) e (mUT-B^[WT] vs UT-B^[T172V] e UT-B^[T334V])] ou injetados com H2O como controle. A expressão heteróloga foi avaliada pela biotinilação das proteínas de superfície, seguida de experimentos de western blot utilizando o anticorpo monoclonal anti-c-Myc. O transporte de ureia foi monitorado através de experimentos de captação de ureia marcada com Carbono^[14]. O transporte de água foi explorado através de experimentos de permeabilidade osmótica à água (Pf), computada através de microscopia de vídeo-imagem do aumento do volume de oócitos expostos à uma solução hipotônica. O transporte de NH3 foi avaliado através da técnica de medidas do pH de superfície (pHS) que utiliza um microeletrodo de vidro com ponta romba, sensível a H^[+], para medir as variações de pH que ocorrem na superfície dos oócitos devido ao influxo resultante de NH3 [(ΔpHS(NH3)].Os resultados de western blot de amostras biotiniladas demonstraram que os oócitos de Lithobates são capazes de expressar as proteínas mUT-A2^[WT], mUT-A3^[WT] e mUT-B^[WT] e os seus respectivos mutantes devido à presença de bandas imunorreativas ao redor de 45-65 kDa, correspondente ao peso molecular de monômeros de UTs glicosilados. As bandas descritas para os UTs estavam ausentes nos blots de amostras biotiniladas de oócitos controle injetado com H2O. Os resultados funcionais demonstraram que os oócitos que expressam mUT-A2^[WT], mUT-A3^[WT] ou mUT-B^[WT] exibiram valores médios de captação de ^[14]C-ureia, Pf e pHS(NH3) sensíveis ao inibidor Floretina significativamente maiores do que aquelas observados para os oócitos UT mutantes ou controle. Assim, este trabalho mostra pela primeira vez que mUT-A2 e mUT-A3 transportam NH3 e utilizam um filtro de seletividade conservado como mecanismo de transporte comum para ureia, água ou NH3. Acreditamos que alterações na expressão e/ou atividade dessas proteínas nos rins poderiam alterar as permeabilidades à ureia, água e/ou NH3, influenciando, desse modo, os mecanismos renais que integram a excreção de resíduos nitrogenados, água e ácido (NH4^[+]). Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (nº 7971160519)
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- Data da defesa: 03.11.2021
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ABNT
LOPES, Neydiana Belize De Pina. Estudo da via de transporte de água e ou amônia através dos transportadores de ureia (UTs) quando expressos em oócitos da rã Lithobates catesbeianus. 2021. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2021. Disponível em: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42137/tde-14012022-235156/. Acesso em: 19 abr. 2024. -
APA
Lopes, N. B. D. P. (2021). Estudo da via de transporte de água e ou amônia através dos transportadores de ureia (UTs) quando expressos em oócitos da rã Lithobates catesbeianus (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42137/tde-14012022-235156/ -
NLM
Lopes NBDP. Estudo da via de transporte de água e ou amônia através dos transportadores de ureia (UTs) quando expressos em oócitos da rã Lithobates catesbeianus [Internet]. 2021 ;[citado 2024 abr. 19 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42137/tde-14012022-235156/ -
Vancouver
Lopes NBDP. Estudo da via de transporte de água e ou amônia através dos transportadores de ureia (UTs) quando expressos em oócitos da rã Lithobates catesbeianus [Internet]. 2021 ;[citado 2024 abr. 19 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42137/tde-14012022-235156/
Informações sobre o DOI: 10.11606/D.42.2021.tde-14012022-235156 (Fonte: oaDOI API)
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