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Tese

Métodos de extração, estabilidade e biodisponibilidade da guanitoxina em cultivos de Sphaeropermopsis torques-reginae analisadas por espectrometria de massas (2020)

  • Authors:
  • Autor USP: FERNANDES, KELLY AFONSINA - FCF
  • Unidade: FCF
  • Sigla do Departamento: FBC
  • Subjects: COMPOSTOS DE FÓSFORO; ESPECTROSCOPIA DE MASSA; BIODISPONIBILIDADE
  • Keywords: Acetilcolinesterase; Acetylcholinesterase; Cianotoxinas; Cyanotoxins; Natural organophosphate; Neurotoxin; Neurotoxina; Organofosforado natural
  • Agências de fomento:
  • Language: Português
  • Abstract: A guanitoxina (GNT) é uma neurotoxina produzida por algumas cepas de cianobactérias dos gêneros Dolichospermum e Sphaerospermopsis>. A GNT é o único organofosforado natural, capaz de causar a morte de animais selvagens e domésticos devido à inibição irreversível da acetilcolinesterase. Apesar de sua alta toxicidade, o diagnóstico da GNT em amostras biológicas ainda é um grande desafio. A dificuldade para sua detecção está diretamente ligada à sua instabilidade em altas temperaturas e pH alcalino, tornando difícil seu monitoramento em corpos d'água. Por isso, esta pesquisa objetivou estudar a estabilidade e biodisponibilidade da GNT em amostras aquosas, com intuito de obter mais informações sobre a natureza química e biológica dessa potente neurotoxina. Para realizar este estudo, a cepa ITEP-24 (S. torques-reginae) produtora de GNT foi cultivada em laboratório sob condições controladas, para obter biomassa para os experimentos de extração, semi-isolamento, estabilidade, ensaio in vitro e identificação por LC-MS/MS. Primeiramente foram realizados testes de extração da GNT partir de células liofilizadas da cepa ITEP-24 utilizando água, metanol e etanol em pH ácido. Depois utilizou-se dois métodos de extração em fase sólida (SPE) com cartuchos preenchidos com fases estacionarias C18 em fase reversa e sílica gel em fase normal, com objetivo de avaliar qual método de SPE seria melhor para extrair e concentrar a GNT. Nós também testamos métodos para lisar as células com sondas de ultrassom, misturador e centrifugação. Além dos métodos de extração, nós avaliamos a estabilidade da toxina em diferentes temperaturas, para isso a biomassa seca contendo a GNT ficou condicionada a 4 °C, 23 °C, -20 °C, -80 °C durantes seis meses, e análises de identificação foram realizadas dentro período de 150 dias em uma sequência de 30 dias. A estabilidadeda toxina foi analisada também a partir de extrações em soluções com diferentes valores de pH (1,5; 3,0; 5,0; 7,0; 8,5; 10,5) e temperatura (23 ºC e 37 ºC). Depois, analisou-se a biodisponibilidade da GNT em células frescas da linhagem ITEP-24 através de teste de dissolução in vitro. O objetivo deste teste foi avaliar a liberação da toxina intracelular em meio simulado do conteúdo gástrica e intestinal com e sem enzimas digestivas para compreender e estimar a disponibilidade da GNT in vivo. Os resultados de todos experimentos descritos neste estudo, foram obtidos a partir de análises por cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC) acoplado ao espectrômetro de massas do tipo triplo quadrupolo LC-QqQ-MS/MS utilizando as transições 253>58, 253>159 e 159>58 [M+H]+ utilizando coluna com fase estacionária zwitteriônica (ZIC). A identificação da GNT foi realizada também por cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas de alta resolução (LC-HR-QTOF-MS) com coluna Luna C18, Hydro-RP C18 e ZIC-HILIC. Dos protocolos de extração testados, a combinação de metanol/água (70:30 v/v) com ácido acético (0.3%) extraiu maior quantidade relativa da GNT a partir de células frescas e liofilizadas da cepa ITEP-24 e a concentração da toxina foi maior em amostras de células frescas. Em relação aos métodos de lise celular, as extrações realizadas em sonda de ultrassom com banho-maria e centrifugação por 1h foram estatisticamente significantes para liberar a toxina intracelular. Não houve diferença significativa entre os testes de SPE, no entanto, a semipurificação da toxina foi melhor com cartucho preenchido com sílica gel em fase normal e adaptação desse método em coluna aberta permitiu obter uma fração enriquecida com GNT. A GNT mostrou ser mais estável em pH ácido, sendo o pH 3,0 o melhor para manter e extrair a toxina emamostras aquosas e a toxina intracelular presente em células secas podem degradar em temperatura de 23 °C por um período de 150 dias mesmo em solução com pH 3,0. Durante os testes de extração e purificação foi observado também a degradação da toxina em processos de secagem e ressuspensão. As análises realizadas no LC-HR-QTOF-MS com diferentes métodos cromatográficos possibilitou a identificação da GNT, porém o método realizado com coluna ZIC-HILIC mostrou melhor resolução cromatográfica dos picos relativos m/z e tempo de retenção de toxina. Os resultados obtidos nos testes de dissolução in vitro mostraram que a GNT fica mais disponível no simulado gástrico com e sem a enzima pepsina, mas também pode ser absorvida no intestino. Portanto, o teste de dissolução in vitro pode ser uma ferramenta útil para a avaliação de risco de cianotoxinas in vivo, devido ao seu potencial de monitorar qualitativa e quantitativamente substâncias dissolvidas em fluidos gastrointestinais. Os resultados apresentados neste estudo fornecem informações valiosas para uma melhor compreensão da estabilidade e biodisponibilidade do GNT. Além disso, os métodos apresentados neste estudo podem ser úteis para diversas aplicações projetadas para identificar a toxina em amostras ambientais, bem como orientações para procedimentos de purificação da GNT.
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 24.04.2020
    • Acesso à fonte
    How to cite
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    • ABNT

      FERNANDES, Kelly Afonsina. Métodos de extração, estabilidade e biodisponibilidade da guanitoxina em cultivos de Sphaeropermopsis torques-reginae analisadas por espectrometria de massas. 2020. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2020. Disponível em: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9143/tde-25062021-164735/. Acesso em: 19 set. 2024.

    • APA

      Fernandes, K. A. (2020). Métodos de extração, estabilidade e biodisponibilidade da guanitoxina em cultivos de Sphaeropermopsis torques-reginae analisadas por espectrometria de massas (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9143/tde-25062021-164735/

    • NLM

      Fernandes KA. Métodos de extração, estabilidade e biodisponibilidade da guanitoxina em cultivos de Sphaeropermopsis torques-reginae analisadas por espectrometria de massas [Internet]. 2020 ;[citado 2024 set. 19 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9143/tde-25062021-164735/

    • Vancouver

      Fernandes KA. Métodos de extração, estabilidade e biodisponibilidade da guanitoxina em cultivos de Sphaeropermopsis torques-reginae analisadas por espectrometria de massas [Internet]. 2020 ;[citado 2024 set. 19 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9143/tde-25062021-164735/

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