L-asparaginase de Erwinia chrysanthemi: expressão proteica livre de células e bioconjugação a bacteriófagos (2020)
- Authors:
- Autor USP: LIMA, GUILHERME MEIRA - FCF
- Unidade: FCF
- Sigla do Departamento: FBT
- Subjects: ENZIMAS; ERWINIA; LEUCEMIA; BIOTECNOLOGIA
- Keywords: Bioconjugação; Bioconjugation; Biofármacos; Biopharmaceutical; Cell-free protein synthesis; Cepuração plasmática; Erwinase; Erwinase; L-asparaginase; L-asparaginase; Plasmatic clearance; Síntese proteica livre de células; Spycatcher; SpyCatcher; Spytag; SpyTag
- Agências de fomento:
- Language: Português
- Abstract: A L-Asparaginase (L-ASNase) de Erwinia chrysathemi (ErA) é uma enzima amplamente utilizada para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA). Embora o seu uso como segunda linha de tratamento para a LLA tenha proporcionado consideráveis benefícios clínicos, reações de hipersensibilidade e rápida depuração plasmática ainda são problemas recorrentes. Ademais, extensivos e custosos processos de produção da ErA são necessários para a obtenção da enzima pura. Com base nesses problemas, o presente trabalho propõe (1) o estudo de viabilidade de expressão da ErA em um sistema de síntese proteica livre de células (SPLC) e (2) a conjugação da proteína em bacteriófagos como ferramenta alternativa para o isolamento e monitoramento da depuração plasmática da ErA. Foram utilizados extratos celulares de Escherichia coli suplementados com solução energética contendo creatina fosfato (CP) como fonte de energia para síntese in vitro de ErA. Para conjugação da ErA a bacteriófagos, o sistema SpyTag/SpyCatcher foi implementado: SpyCatcher foi fusionado à porção N-terminal da ErA e bacteriófagos filamentosos da linhagem M13 e fd foram modificados de modo a expressar SpyTag nas proteínas de capsídeo pIII e pVIII, respectivamente. Em relação ao primeiro objetivo, o sistema de SPLC foi capaz de expressar a ErA com atividade. A proteína foi expressa na fração solúvel e apresentou atividade enzimática significativamente superior em relação à reação controle (7,07 ± 0,68 U/mL vs. 1,83 ± 0,14 U/mL). Tempo necessário para obtenção do extrato celular foi reduzido de 45 para 26 hrs, e sete componentes da solução energética foram removidos da composição original sem implicações negativas na eficiência de expressão da ErA, simplificando desta forma o processo de SPLC. Em relação ao segundo objetivo, ErA fusionada à SpyCatcher (SpyCatcher_ErA) foi conjugaconjugada com êxito em bacteriófagos capazes de expressar SpyTag fusionadas na porção N-terminal das proteínas pIII (SpyTag_pIII) e pVIII (SpyTag_pVIII). A porcentagem de formação dos conjugados entre SpyCatcher_ErA e SpyTag_pIII ((ErA)5-pIII) foi de 6% enquanto formação dos conjugados entre SpyCatcher_ErA e SpyTag_pVIII ((ErA)50-pVIII) foi de 46%, valores estes confirmados por atividade enzimática. Solução contendo conjugados foram injetados em camundongos e sequenciados/titulados com êxito. Não houve diferença de depuração plasmática entre (ErA)5-pIII e bacteriófago controle, mas houve maior taxa de eliminação de (ErA)50-pVIII em relação ao mesmo bacteriófago não conjugado à SpyCatcher_ErA. Os resultados aqui apresentados confirmam ser possível expressar ErA com atividade biológica em sistemas de SPLC. Além disso, o sistema de conjugação da ErA a bacteriófagos aqui desenvolvido foi capaz de monitorar a concentração de ErA presente na circulação em função do tempo, tornando-se uma potencial plataforma de desenvolvimento de novas proteoformas da ErA com características clínicas melhoradas.
- Imprenta:
- Data da defesa: 15.09.2020
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ABNT
LIMA, Guilherme Meira e MONTEIRO, Gisele. L-asparaginase de Erwinia chrysanthemi: expressão proteica livre de células e bioconjugação a bacteriófagos. 2020. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2020. Disponível em: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-04122020-001833/. Acesso em: 12 mar. 2026. -
APA
Lima, G. M., & Monteiro, G. (2020). L-asparaginase de Erwinia chrysanthemi: expressão proteica livre de células e bioconjugação a bacteriófagos (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de https://teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-04122020-001833/ -
NLM
Lima GM, Monteiro G. L-asparaginase de Erwinia chrysanthemi: expressão proteica livre de células e bioconjugação a bacteriófagos [Internet]. 2020 ;[citado 2026 mar. 12 ] Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-04122020-001833/ -
Vancouver
Lima GM, Monteiro G. L-asparaginase de Erwinia chrysanthemi: expressão proteica livre de células e bioconjugação a bacteriófagos [Internet]. 2020 ;[citado 2026 mar. 12 ] Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-04122020-001833/ - DNA-encoded multivalent display of protein tetramers on phage: synthesis and in vivo applications
- L-Asparaginase from E. chrysanthemi expressed in glycoswitch: effect of His-Tag fusion on the extracellular expression
- Engineered Asparaginase from Erwinia chrysanthemi enhances asparagine hydrolase activity and diminishes enzyme immunoreactivity
- Glycosylation of Erwinase results in active protein less recognized by antibodies
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