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Tese

Padronização e caracterização do cultivo tridimensional de células HepaRG para sua utilização como ferramenta alternativa na avaliação da autofagia modulada pelo retardante de chama 2,2',4,4' tetrabromodifenil éter, o BDE-47 (2019)

  • Authors:
  • Autor USP: MIRANDA, RAUL GHIRALDELLI - FFCLRP
  • Unidade: FFCLRP
  • Sigla do Departamento: 593
  • Subjects: QUÍMICA; ALGINATOS; LINHAGEM CELULAR
  • Agências de fomento:
  • Language: Português
  • Abstract: Desde a proposta dos 3Rs por Russel e Burch, vários esforços vêm sendo feitos para “reduzir, refinar e substituir" o uso de animais em ensaios toxicológicos. Linhagens de células humana surgem como alternativa, porém, em longos períodos cultivadas em ambiente 2D, as células começam a perder características importantes. A cultura 3D emerge aqui, uma vez que pode formar esferoides celular mimetizando arquitetura e características teciduais in vivo, provendo uma nova perspectiva para os ensaios toxicológicos, um exemplo de cultivo 3D é o cultivo em microesferas de alginato o qual é um modelo de fácil manipulação e manutenção. A linhagem utilizada neste trabalho foi a HepaRG, uma linhagem de hepatocarcinoma humano e quando cultivada em 3D pode manter e reproduzir as características dos hepatócitos, para avaliar a toxicidade dos éteres de bifenila polibromados (PBDEs). Estes, são contaminantes ambientar muito utilizado na prevenção de incêndios, como retardante de chama. Sabe-se que o congénere BDE - 47 aumenta o estresse oxidativo e pode induzir a morte de células HepG2, além disso, o processo autofágico pode estar relacionado com o mecanismo de toxicidade do congênere. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi implementar, caracterizar e padronizar o modelo de cultivo de células HepaRG em microesferas de alginato utiliza-lo na avaliação da modulação da autofagia pelo BDE-47. Assim, os esferoides HepaRG cresceram com uma taxa de crescimento de 0,2036 e tempo de duplicação (Td) de 35,48h até o quarto dia, quando a cultura estagna e volta a crescer no quinto dia com uma taxa de crescimento de 0,1123 e Td de 64,35h. Pela reconstrução 3D é possível verificar o crescimento dos esferoides e sua estrutura que pode chegar a 25000µm2 após 15 dias de cultivo. Na histologia, não se encontrou núcleos necróticos ou apoptótico na marcação por H&E em até 14 diasde cultura, podendo observar a formação de matriz extracelular e também estocagem de glicogênio, nas marcações de Tricrômio de Masson e PAS, respectivamente. Após exposição ao BDE - 47 por 48h na concentração de 50µM a capacidade de redução do MTT pelos esferoides HepaRG foi reduzida significantemente. As concentrações de 10 e 25µM foram capazes de causar um aumento da LC3-II quando na ausência de NH4Cl e 25µM uma diminuição da LC3-I na presença de NH4Cl, consequente aumento da razão LC3-IULC3-I, quando avaliado por western blot (WB). Por outro lado, a expressão proteína SQSTM1/p62 na presença do NH4Cl diminuiu nas concentrações de 10 e 25µM do congênere. Houve também um aumento do padrão pontuado da LC3 por imunofluorescência, nessas mesmas condições. O tratamento tempo-dependente de 25µM do BDE-47 mostrou dois picos autofágicos em 12 e 24h na imunofluorescência e 9 e 24h por WB. Desta maneira, o cultivo de HepaRG em microesferas de alginato foi implementado, caracterizado e padronizado, apresentando uma boa performance e aplicabilidade. A exposição ao BDE-47 foi capaz de induzir a autofagia nas concentrações de 10 e 25µM, além de apresentar dois picos autofágicos, um entre 9 e 12h e outro em 24h, após exposição a 25µM do BDE-47
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 05.08.2019
    • How to cite
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    • ABNT

      MIRANDA, Raul Ghiraldelli. Padronização e caracterização do cultivo tridimensional de células HepaRG para sua utilização como ferramenta alternativa na avaliação da autofagia modulada pelo retardante de chama 2,2',4,4' tetrabromodifenil éter, o BDE-47. 2019. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2019. . Acesso em: 19 abr. 2024.

    • APA

      Miranda, R. G. (2019). Padronização e caracterização do cultivo tridimensional de células HepaRG para sua utilização como ferramenta alternativa na avaliação da autofagia modulada pelo retardante de chama 2,2',4,4' tetrabromodifenil éter, o BDE-47 (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.

    • NLM

      Miranda RG. Padronização e caracterização do cultivo tridimensional de células HepaRG para sua utilização como ferramenta alternativa na avaliação da autofagia modulada pelo retardante de chama 2,2',4,4' tetrabromodifenil éter, o BDE-47. 2019 ;[citado 2024 abr. 19 ]

    • Vancouver

      Miranda RG. Padronização e caracterização do cultivo tridimensional de células HepaRG para sua utilização como ferramenta alternativa na avaliação da autofagia modulada pelo retardante de chama 2,2',4,4' tetrabromodifenil éter, o BDE-47. 2019 ;[citado 2024 abr. 19 ]

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