Desenvolvimento de uma tecnologia para produção e purificação do fator estimulador de colônia de granulócito humano recombinante produzido em Escherichia coli (2018)
- Authors:
- Autor USP: EGUIA, FARA AMELIA PRIMELLES - BIOTECNOLOGIA
- Unidade: BIOTECNOLOGIA
- Subjects: GRANULÓCITOS; PROTEÍNAS RECOMBINANTES; ESCHERICHIA COLI; REATORES BIOQUÍMICOS; PLASMÍDEOS; WESTERN BLOTTING; NEUTRÓFILOS; PROLIFERAÇÃO CELULAR
- Keywords: auto-induction medium; bioreactor cultivation; cultivo em biorreator; estabilidade plasmidial; meio de autoindução; plasmid stability; purificação; refolding, purification; renaturação; rhG-CSF; rhG-CSF
- Language: Português
- Abstract: Os neutrófilos são glóbulos brancos do sangue e primeira linha de defesa contra as bactérias. A proliferação destas células é principalmente controlada pelo Fator Estimulador de Colônia de Granulócito (G-CSF). O G-CSF humano recombinante (rhG-CSF) é um medicamento amplamente utilizado para tratar a neutropenia, condição caracterizada pela contagem de neutrófilos abaixo de 1.500/mm3. O rhG-CSF já foi obtido no Centro de Biotecnologia do Instituto Butantan em E. coli como corpos de inclusão (CI), reportando-se instabilidade do plasmídeo e baixo rendimento. Neste trabalho, o plasmídeo pARKAN-I foi avaliado para produzir rhG-CSF em E. coli e viabilizar sua obtenção em biorreator. Esse vetor carrega a sequência pAR, inserida para aumentar sua estabilidade. E. coli BL21 (DE3) Star pLysS transformada com pARKAN-I/rhG-CSF foi cultivada em frascos agitados para avaliação da estabilidade do plasmídeo em meios complexos (2YT e de autoindução) e quimicamente definido (HDF). Avaliou-se a influência de indutores (IPTG e lactose), glicose e antibióticos sobre a estabilidade plasmidial. A fim de se obter material para purificação, foram realizados cultivos em biorreator com meio de autoindução sem antibióticos em modo batelada e HDF com antibióticos em modo batelada alimentada, a 30ºC, 30% de oxigênio e pH 6,8. As etapas de purificação incluíram: lise em homogeneizador contínuo de alta pressão, lavagens, solubilização e renaturação dos CI, e cromatografia de troca catiônica em SP-Sepharose.Avaliaram-se três métodos de renaturação: diafiltração, diálise e diluição. A estabilidade do plasmídeo foi avaliada pela percentagem de colônias obtidas em placas de LB-ágar com antibiótico em relação às colônias que cresceram nas placas de LB-ágar sem antibiótico. A identidade proteica foi determinada por SDS-PAGE e Western Blotting. A pureza relativa e a produção específica do rhG-CSF foram determinadas por densitometria das bandas da eletroforese. A quantificação proteica foi feita pelo método do ácido bicinconínico. Nos cultivos em frascos com meio 2YT sem glicose, o crescimento foi mais lento, porém a fase exponencial mais prolongada, alcançando concentração celular (Cx) mais elevada (2,56 g/L) do que as culturas com glicose (Cx1,35 g/L), que cresceram mais rápido e chegaram primeiro à fase estacionária. O cultivo com meio de autoindução proporcionou crescimento similar ao do meio 2YT sem glicose. Em meio HDF, os cultivos tiveram o crescimento mais lento e menor Cx (0,94 g/L). Os meios 2YT e de autoindução mostraram 100% de colônias resistentes à canamicina antes e após indução, exceto o 2YT sem antibiótico e sem glicose, com 97,5% e 94,1% após 6 e 8 h de indução, respectivamente, coincidindo com a maior produção de rhG-CSF. Em frascos, o meio HDF com antibiótico teve 93% de colônias resistentes antes da indução dos cultivos em frascos, diminuindo até 85% após 4 h de indução, com baixa produção do rhG-CSF, verificada apenas por Western Blotting.Os cultivos embiorreator mostraram baixa velocidade específica de crescimento (0,30 h-1), porém elevada Cx e produção de rhG-CSF, sendo superior no meio de autoindução, que também resultou mais barato do que o HDF. O método de diluição em tampão tris 20 mM pH 8,0 com EDTA 2 mM, Triton X-100 0,1% e glicerol 10% apresentou maior percentagem de renaturação. Foi estabelecido um processo de purificação que permitiu obter rhG-CSF com 87% de pureza, integridade estrutural e atividade biológica. O plasmídeo pARKAN-I, vetor sem restrições de propriedade intelectual e proteção de patente, mostrou alta estabilidade nos meios complexos avaliados, tanto em frasco como em biorreator, permitindo produzir rhG-CSF em larga escala sem adição de antibióticos ao meio de cultura, o que reduziu o custo do processo de obtenção
- Imprenta:
- Data da defesa: 28.05.2018
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ABNT
EGUIA, Fara Amelia Primelles. Desenvolvimento de uma tecnologia para produção e purificação do fator estimulador de colônia de granulócito humano recombinante produzido em Escherichia coli. 2018. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2018. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-04042019-143511/. Acesso em: 14 nov. 2024. -
APA
Eguia, F. A. P. (2018). Desenvolvimento de uma tecnologia para produção e purificação do fator estimulador de colônia de granulócito humano recombinante produzido em Escherichia coli (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-04042019-143511/ -
NLM
Eguia FAP. Desenvolvimento de uma tecnologia para produção e purificação do fator estimulador de colônia de granulócito humano recombinante produzido em Escherichia coli [Internet]. 2018 ;[citado 2024 nov. 14 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-04042019-143511/ -
Vancouver
Eguia FAP. Desenvolvimento de uma tecnologia para produção e purificação do fator estimulador de colônia de granulócito humano recombinante produzido em Escherichia coli [Internet]. 2018 ;[citado 2024 nov. 14 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-04042019-143511/
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