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Reconhecimento molecular de septinas: estudos da interface entre SEPT7 e SEPT12 (2018)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: CASTRO, DANIELLE KAROLINE SILVA DO VALE - IQSC
  • Unidades: IQSC
  • Subjects: PROTEÍNAS
  • Keywords: SEPTINAS
  • Language: Português
  • Abstract: A família das septinas caracteriza-se pela capacidade de ligar nucleotídeos de guanina e de se associarem formando filamentos. Diversas funções biológicas têm sido reportadas para esses filamentos e sua dissociação pode estar relacionada a patologias. A septina 12 humana expressa especificamente em testículos, foi identificada em filamentos que compõem o annulus do espermatozoide, cuja integridade está relacionada com a morfologia deste. Embora muitos estudos tenham sido reportados, vários aspectos das bases moleculares e fisiológicas de sua função e automontagem permanecem desconhecidos. Neste trabalho, procurou-se obter informações estruturais para o domínio de ligação ao nucleotídeo da SEPT12 (SEPT12G), do mutante SEPT12GT89M e do heterodímero SEPT7-SEPT12. A expressão destas proteínas foi realizada em células de E. coli da linhagem Rosetta(DE3) pelos vetores de expressão pET28a(+) e pETDuet-1. As etapas de purificação foram cromatografia de afinidade e exclusão molecular. A proteína SEPT12G foi submetida à avaliação do estado oligomérico, fluorescência intrínseca, ensaios de conteúdo de nucleotídeo, atividade GTPásica e transição térmica. O heterodímero SEPT7-SEPT12 foi submetido à avaliação do estado oligomérico e conteúdo de nucleotídeo. Ensaios de cristalização foram realizados para todas as proteínas. A coleta de dados realizada na linha I24 do Diamond Light Source (Didcot, Inglaterra) resultou em conjuntos de dados de alta resolução para a SET12G, SEPT12GT89M e baixa resolução para a SEPT7NGcOs estudos biofísicos mostraram que a SEPT12G foi obtida em sua forma nativa ou, seja, capaz de ligar e hidrolisar o nucleotídeo GTP e que o heterodímero obtido apresentou ambas as proteínas. As estruturas cristalográficas foram resolvidas e permitiram realizar observações importantes para o grupo I das septinas humanas (SEPT3, SEPT9 e SEPT12). Para a SEPT12 pôde-se observar como a mudança que ocorre no motivo G4 pode alterar a estabilidade da interface G. No contexto do grupo I esta estrutura permitiu concluir que todas as proteínas deste subgrupo podem formar duas interfaces NC, dos tipos aberta e fechada. Além disso, reforçou a observação da orientação diferencial da hélice α5', cuja função ainda não está esclarecida, mas sem dúvidas é um diferencial que caracteriza este grupo, possivelmente relacionado com a ancoragem da região polibásica na conformação aberta. A estrutura cristalográfica do mutante SEPT12T89M permitiu observar que a mutação levou a uma alteração na primeira esfera de coordenação do íon Mg2+, mudança que interrompe o mecanismo do switch universal e deixa a proteína catalíticamente inativa. Por fim, o estudo cristalográfica do complexo entre a SEPT12 e SEPT7 não foi possível, uma vez que todas as tentativas resultaram em cristais contendo apenas a SEPT7, o que pode ser consequência da precipitação da SEPT12 ou da condição de cristalização utilizada, que desestabiliza o heterodímero
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 30.07.2018

  • How to cite
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    • ABNT

      CASTRO, Danielle Karoline Silva do Vale; GARRATT, Richard Charles. Reconhecimento molecular de septinas: estudos da interface entre SEPT7 e SEPT12. 2018.Universidade de São Paulo, São Carlos, 2018. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75133/tde-04122018-135816/publico/DanielleKarolineSilvadoValleCastrocorrigidaunlocked.pdf >.
    • APA

      Castro, D. K. S. do V., & Garratt, R. C. (2018). Reconhecimento molecular de septinas: estudos da interface entre SEPT7 e SEPT12. Universidade de São Paulo, São Carlos. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75133/tde-04122018-135816/publico/DanielleKarolineSilvadoValleCastrocorrigidaunlocked.pdf
    • NLM

      Castro DKS do V, Garratt RC. Reconhecimento molecular de septinas: estudos da interface entre SEPT7 e SEPT12 [Internet]. 2018 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75133/tde-04122018-135816/publico/DanielleKarolineSilvadoValleCastrocorrigidaunlocked.pdf
    • Vancouver

      Castro DKS do V, Garratt RC. Reconhecimento molecular de septinas: estudos da interface entre SEPT7 e SEPT12 [Internet]. 2018 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75133/tde-04122018-135816/publico/DanielleKarolineSilvadoValleCastrocorrigidaunlocked.pdf

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