Padronização, otimização e caracterização bioquímica/biofísica da expressão de NPP1 e Anexina V (2018)
- Authors:
- Autor USP: JANKU, TATIANE APARECIDA BUZANELLO - FFCLRP
- Unidade: FFCLRP
- Sigla do Departamento: 593
- Subjects: BIOMINERALIZAÇÃO; PROTEÍNAS RECOMBINANTES; OSSO E OSSOS
- Keywords: Anexina V; Annexin V; Biomineralização; Bone biomineralization; NPP1
- Language: Português
- Abstract: O processo de biomineralização óssea é a deposição de cristais de fosfato de cálcio, na forma de hidroxiapatita formando o tecido ósseo. São mediados pelas vesículas da matriz (MVs) que são liberadas no local específico do início da biomineralização. As MVs contêm altas concentrações de íons Ca2+ e fosfato inorgânico (Pi), proporcionando um microambiente adequado para a formação inicial e propagação dos cristais de hidroxiapatita. Para que isso ocorra corretamente são necessárias diversas proteínas/enzimas, bem como microambientes com condições específicas. Neste trabalho uma atenção especial foi dada a duas proteínas presentes nas MVs: Anexina V (AnxA5) e a nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase-1 (NPP1). A Anexina V é responsável pela formação de um canal de cálcio por meio da associação desta proteína tanto com a face externa quanto interna da membrana das MVs. A NPP1 possui a função principal de hidrolisar adenosina trifosfato (ATP), formando adenosina monofosfato (AMP) e pirofosfato (PPi). Assim, experimentos de expressão de Anexina V e NPP1 foram realizados com o intuito de iniciar os estudos de interação entre as duas proteínas, por meio de reconstituição em lipossomos. A expressão de Anexina V foi realizada em células E. coli BL21(DE3) e induzida por isopropil -D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG); para purificação, três procedimentos foram necessários, utilizando coluna de níquel, coluna Desalting e coluna de troca iônica (Mono-Q). Experimentos de dicroísmo circularforam realizados com amostras de Anexina V após purificação e mostraram que todas as amostras apresentavam estruturas em -hélice. Pelo método da gota pendente foi estudada a interação de Anexina V com íons Ca2+ (10 mM) em monocamadas constituídas por dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) e de uma mistura de composição lipídica 9:1 de DPPC e dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS). Os dados obtidos mostraram alta afinidade de Anexina V por monocamadas constituídas de (9:1) DPPC:DPPS na presença de íons Ca2+. A expressão de NPP1 foi realizada com transfecção por meio de eletroporação do DNA recombinante em células COS-1, e seleção com antibiótico G418 após 24 horas de cultivo. Amostras de fração de membrana controle e NPP1 recombinante foram preparadas após 60 horas de cultivo celular e foi observada atividade catalítica na amostra de fração de membrana da NPP1. Todas as amostras de expressão, tanto de Anexina V e NPP1, foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida. A padronização da Anexina V foi obtida com sucesso, porém com relação à NPP1, experimentos ainda devem ser realizados a fim de padronizar a obtenção desta proteína recombinante em quantidade suficiente para continuar os estudos
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2018
- Data da defesa: 23.02.2018
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ABNT
JANKU, Tatiane Aparecida Buzanello. Padronização, otimização e caracterização bioquímica/biofísica da expressão de NPP1 e Anexina V. 2018. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2018. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-03042018-080740/. Acesso em: 09 nov. 2024. -
APA
Janku, T. A. B. (2018). Padronização, otimização e caracterização bioquímica/biofísica da expressão de NPP1 e Anexina V (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-03042018-080740/ -
NLM
Janku TAB. Padronização, otimização e caracterização bioquímica/biofísica da expressão de NPP1 e Anexina V [Internet]. 2018 ;[citado 2024 nov. 09 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-03042018-080740/ -
Vancouver
Janku TAB. Padronização, otimização e caracterização bioquímica/biofísica da expressão de NPP1 e Anexina V [Internet]. 2018 ;[citado 2024 nov. 09 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-03042018-080740/ - Expressão heteróloga, purificação, caracterização e estudos de modelagem molecular das proteínas quinases: piridoxal quinase (PdxK) de Trypanosoma cruzi e quinase dependente de ciclina 10 (CDK10) hum
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