Desenvolvimento e validação de método para a identificação de micro-organismos metabolicamente ativos em biofilmes de amostras ambientais através da análise de rRNA 16S (2018)
- Authors:
- Autor USP: NAMMOURA NETO, GEORGES MIKHAEL - ICB
- Unidade: ICB
- Sigla do Departamento: BMM
- Subjects: BIOFILMES; REAÇÃO EM CADEIA POR POLIMERASE; MICROBIOLOGIA AMBIENTAL; SEQUENCIAMENTO GENÉTICO; ATIVAÇÃO ENZIMÁTICA; BACTÉRIAS; RNA; DNA POLIMERASES; ENZIMAS
- Keywords: Amostras ambientais; ARDRA; ARDRA; Bácterias metabolicamente ativas; Environmental samples; Extração de RNA; Metabolically active bacteria; MiSeq; MiSeq; RNA extract; RT-PCR; RT-PCR
- Language: Português
- Abstract: A otimização e padronização de métodos moleculares são fundamentais para evitar distorções nos resultados causadas por processamento de ácidos nucleicos da abundância relativa de micro-organismos de uma amostra. Nos estudos sobre identificação microbiana, a etapa de validação é, na maioria dos casos, negligenciada. As principais etapas em que podem ocorrer vieses capazes de alterar a informação sobre a composição da comunidade microbiana são a extração e a RT-PCR. O rRNA é a molécula ideal para identificar os micro-organismos metabolicamente ativos por estar em maior quantidade dentro da célula. A inexistência de um protocolo de extração de RNA gold standard e de kits comerciais específicos para cada tipo de amostra ambiental pode comprometer as etapas posteriores à extração. O protocolo de extração de RNA adaptado neste trabalho mostrou alta eficácia na lise celular e na remoção de contaminantes co-extraidos, garantindo a integridade e a qualidade do rRNA extraído de amostras contendo altas concentrações de contaminantes. Devido as diferentes características químicas das amostras ambientais, o uso deste protocolo adaptado pode preservar a informação sobre os indivíduos metabolicamente ativos de uma comunidade microbiana. Foram utilizados consórcios artificiais na validação da etapa de PCR. O efeito sinérgico do uso de aditivos, da Taq polimerase de alto rendimento, do programa de sub-ciclagem e da limitação do programa de amplificação em 10 ciclos, mantiveram a proporção dos moldes dos consórcios analisados próximo ao esperado.Após a padronização da técnica de ARDRA, foi definido que há necessidade de entre 500 e 550 UFC para uma cobertura completa da diversidade de lodo ativado. O uso de enzimas combinadas MspI/HaeIII e HhaI/RsaI em uma mesma reação double digest proporcionou a separação dos clones de lodo ativado utilizando menos etapas de ARDRA. E o critério de corte em 3% do total agrupamentos, possibilitou selecionar os perfis mais representativos sem a perda de grupos importantes para a análise das bibliotecas. Foi concluído que, o uso de um protocolo inadequado de extração de RNA de amostras complexas pode gerar extratos contendo contaminantes co-extraidos que interferem na atividade da Taq polimerase e nas enzimas de restrição. Após o sequenciamento de nova geração, foi observado que o uso de diferentes iniciadores de PCR e do pré-processamento manual para os dados obtidos, foram essenciais para ampliar a cobertura observada para a amostra de lodo e melhorar a resolução dos resultados e a profundidade de identificação taxonômica, respectivamente
- Imprenta:
- Data da defesa: 19.02.2018
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ABNT
NAMMOURA NETO, Georges Mikhael. Desenvolvimento e validação de método para a identificação de micro-organismos metabolicamente ativos em biofilmes de amostras ambientais através da análise de rRNA 16S. 2018. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2018. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-26032018-164037/. Acesso em: 30 set. 2024. -
APA
Nammoura Neto, G. M. (2018). Desenvolvimento e validação de método para a identificação de micro-organismos metabolicamente ativos em biofilmes de amostras ambientais através da análise de rRNA 16S (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-26032018-164037/ -
NLM
Nammoura Neto GM. Desenvolvimento e validação de método para a identificação de micro-organismos metabolicamente ativos em biofilmes de amostras ambientais através da análise de rRNA 16S [Internet]. 2018 ;[citado 2024 set. 30 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-26032018-164037/ -
Vancouver
Nammoura Neto GM. Desenvolvimento e validação de método para a identificação de micro-organismos metabolicamente ativos em biofilmes de amostras ambientais através da análise de rRNA 16S [Internet]. 2018 ;[citado 2024 set. 30 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-26032018-164037/
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