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Caracterização estrutural, bioquímica e funcional de uma proteína do tipo hnRNPA/B identificada em neurónios de lula (2017)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: LOPES, GABRIEL SARTI - FMRP
  • Unidades: FMRP
  • Sigla do Departamento: RBP
  • Subjects: CÉLULAS; BIOLOGIA CELULAR; BIOLOGIA MOLECULAR
  • Language: Português
  • Abstract: Anteriormente, caracterizamos uma proteína básica (65 kDa; pI 9,3), ligante de RNA (p65), nos terminais pré-sinápticos de lula. Hipotetizamos que p65 pudesse ser um hetero ou homodímero composto por pelo menos um, de dois peptídeos distintos do tipo hnRNPA/B, altamente homólogos, designados como proteínas 1 (36.3 kDa, pI 7.1) e 2 (37.6 kDa, pI 8.9). Sendo a proteína 2 de lula um peptídeo básico como p65, nosso objetivo foi a sua caracterização estrutural, bioquímica e funcional, inclusive investigar a possível formação de homodímero. O alinhamento das proteínas 1 e 2 de lula com as proteínas humanas hnRNPA1 e hnRNPA2B1, mostrou alto grau de homologia entre suas sequências, principalmente motivos de interação com RNA (N-terminal) e região rica em glicina contendo sequências RGG (C-terminal). Geramos um modelo estrutural/tridimensional in silico da região Nterminal da proteína 2, usando como molde a estrutura cristalográfica da proteína humana hnRNPA1. Ambas estruturas apresentam correspondência muito próximas, com um desvio médio de 0,279 A. Análises in silico mostraram ser posssível a formação de um homodímero estável da proteína 2. Experimentos de dicroísmo circular feito com a proteína 2 recombinante (rP2) indicaram a presença de alfa-helice e folha beta, já o espalhamento dinâmico de luz mostrou que rP2 possui um raio hidrodinamico 1,5 vezes maior do que o esperado para uma proteína com seu peso molecular (40 kDa). A similaridade entre as estruturas dessas moléculas, de lulas a humanos, sugere que suas propriedades e funções são altamente conservadas. Para compreender melhor as propriedades celulares e funções da proteína 2 de lula, avaliamos tanto a marcação de anticorpos policlonais gerados contra a proteína 2 (antirP2), quanto a expressão de rP2 em fusão com GFP ou mCherry, em um modelo neuronal humano (células SH-SY5Y). Anticorpos anti-rP2 reconhecemp65 e uma subunidade (p37) em western blot de lisado de lóbulo óptico de lula. Em lisado de células SH-SYSY, anti-rP2 reconhece proteínas hnRNPA1 e hnRNPH. Em células SH-SY5Y, esse anticorpo marca predominantemente o núcleo, ocupando regiões de "speckles". A expressão de GFP-rP2 em células SH-SY5Y também é nuclear. Notavelmente, quando as células são estressadas com arsenito de sódio, formam-se granulos de GFP-rP2 no núcleo, enquanto que, quando as células são estressadas com sorbitol, GFP-rP2 localiza-se em granulos de estresse (SG) citoplasmáticos, junto com a proteína humana hnRNPA1 e PABP. A associação de GFP-rP2 em SG mostra-se móvel em experimentas de recuperação após estresse e aplicação da técnica de FRAP, enquanto que nos grânulos nucleares a aplicação de FRAP mostrou uma cinética lenta e baixa recuperação de GFP-rP2. A expressão de rP2 truncada no C-terminal (GFP-rP2aa1- 296) faz com que rP2 truncada localize-se em grânulos citoplasmáticos, indicando possível função no transporte citoplasma-núcleo de rP2. A expressão da sequência de rP2 correspondente à sequência de localização nuclear (M9/NTS) (GFP-rP2aa297-349) é necessária, mas não suficiente para direcionar a localização nuclear de rP2. Demonstramos alta homologia em estrutura molecular da proteína 2 de lula com proteínas humanas da família hnRNPA/B, e similaridade em algumas atividades e propriedades celulares associadas com o transporte citoplasma-núcleo e resposta ao estresse celular
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 29.09.2017

  • How to cite
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    • ABNT

      LOPES, Gabriel Sarti; PAÇO-LARSON, Maria Luísa. Caracterização estrutural, bioquímica e funcional de uma proteína do tipo hnRNPA/B identificada em neurónios de lula. 2017.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017.
    • APA

      Lopes, G. S., & Paço-Larson, M. L. (2017). Caracterização estrutural, bioquímica e funcional de uma proteína do tipo hnRNPA/B identificada em neurónios de lula. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
    • NLM

      Lopes GS, Paço-Larson ML. Caracterização estrutural, bioquímica e funcional de uma proteína do tipo hnRNPA/B identificada em neurónios de lula. 2017 ;
    • Vancouver

      Lopes GS, Paço-Larson ML. Caracterização estrutural, bioquímica e funcional de uma proteína do tipo hnRNPA/B identificada em neurónios de lula. 2017 ;

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