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Estudos funcionais e bioquímicos sobre o reconhecimento e inibição de efetores de um sistema de secreção  tipo IV de Xanthomonas citri subsp. citri (2017)

  • Authors:
  • Autor USP: OKA, GABRIEL UMAJI - IQ
  • Unidade: IQ
  • Sigla do Departamento: QBQ
  • Subjects: MICROBIOLOGIA AMBIENTAL; BIOQUÍMICA; SECREÇÃO
  • Language: Português
  • Abstract: Sistemas de Secreção Tipo IV (T4SSs), normalmente compostos por 12 proteínas (VirB1-VirB11 e VirD4) são tipicamente associados às funções de conjugação bacteriana e transferência de fatores de patogenicidade para células hospedeiras. Mas também, muitas espécies da ordem Xanthomonadales possuem um T4SS associado a matar bactérias. O modelo atual de morte de uma célula-alvo mediada pelo T4SS é baseado na secreção de toxinas denominadas XVIPs ("Xanthomonas VirD4 interacting proteins") ou X-Tfe (Xanthomonadaceae-T4SS effector) no qual cada XVIP/X-Tfe apresenta uma proteína de imunidade cognata denominada X-Tfi (Xanthomonadaceae-T4SS immunity protein). Demonstramos que um XVIP, XAC2609, é secretado através do T4SS de modo que depende de contato célula-célula e do seu domínio XVIPCD ("XVIP conserved domains"). A porção N-terminal de XAC2609 codifica um domínio GH19 que cliva a peptideoglicana de E. coli, mas perde a sua atividade na presença do seu inibidor cognato, o X-Tfi XAC2610. Portanto, XAC2609/XAC2610 formam um par de proteínas efetora/imunidade associado ao T4SS de X. citri. Através de diferentes técnicas de microscopias utilizando a cepa Δxac2610, foi observado que XAC2610 protege o envelope celular de X. citri contra efeitos de autólise celular promovidos pela atividade de XAC2609. Ensaios funcionais baseados nas observações de fenótipos de colônias e de formação de biofilme mostraram que XAC2610 confere imunidade para X. citri contra uma atividade 7 intrínseca de XAC2609. A proteína com o papel de reconhecer os substratos através da interação com os sinais de secreção do T4SS é VirD4. No T4SS de X. citri, existe a hipótese de que o domínio XVIPCD seja o sinal de secreção presente nas XVIPs. Logo, os aspectos bioquímicos e biofísicos da interação VirD4-XVIPCD foram investigados através de experimentos de co-purificação por cromatografia de afinidade eexclusão molecular, RMN e SAXS. Demonstramos que o domínio AAD de VirD4 (VirD4AAD) está associado a interagir especificamente com o domínio XVIPCD de XAC2609 (XAC2609XVIPCD), formando um heterodímero em solução. VirD4AAD é um domínio globular e monomérico e XAC2609XVIPCD é desenovelado mas se enovela concomitante à interação com VirD4AAD. Construções de XAC2609 contendo mutações pontuais no domínio XVIPCD foram utilizadas em ensaios in vivo de secreção pela X. citri e ensaios in vitro de interação com VirD4AAD por titulação monitorada por calorimetria isotérmica (ITC). Através desses experimentos, observamos que uma forte interação entre VirD4AAD-XAC2609XVIPCD é essencial para secreção de XAC2609 via o T4SS. Esses resultados permitem concluir que o domínio XVIPCD é o sinal de secreção dos substratos do T4SS de X. citri e que o AAD confere especificidade à VirD4 por interagir com o XVIPCD. Finalmente, através de ensaios de competições bacterianas entre E. coli e X. citri, foram observados diferentes fenótipos associados à função do T4SS: i) nocautes gênicos das subunidades estruturais VirB5, VirB11 abolem a função do T4SS em X. citri.; ii) nocautes de xac2611, apresentaram uma maior vantagem adaptativa do que a cepa selvagem de X. citri em competições e a expressão epissomal de XAC2611 inibe fortemente a função do T4SS e iii) a atividade ATPásica de VirD4 é essencial para a função do sistema e a expressão de mutantes 8 de VirD4 exerce um fenótipo de dominância negativa sobre a função do T4SS em X. citri.
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 03.10.2017
  • Acesso à fonte
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    • ABNT

      OKA, Gabriel Umaji; FARAH, Chuck Shaker. Estudos funcionais e bioquímicos sobre o reconhecimento e inibição de efetores de um sistema de secreção  tipo IV de Xanthomonas citri subsp. citri. 2017.Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-14122017-111951/ >.
    • APA

      Oka, G. U., & Farah, C. S. (2017). Estudos funcionais e bioquímicos sobre o reconhecimento e inibição de efetores de um sistema de secreção  tipo IV de Xanthomonas citri subsp. citri. Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-14122017-111951/
    • NLM

      Oka GU, Farah CS. Estudos funcionais e bioquímicos sobre o reconhecimento e inibição de efetores de um sistema de secreção  tipo IV de Xanthomonas citri subsp. citri [Internet]. 2017 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-14122017-111951/
    • Vancouver

      Oka GU, Farah CS. Estudos funcionais e bioquímicos sobre o reconhecimento e inibição de efetores de um sistema de secreção  tipo IV de Xanthomonas citri subsp. citri [Internet]. 2017 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-14122017-111951/


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