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Identificação e caracterização de proteínas que se ligam a actina (ABPs) no apicomplexa Neospora caninum (2017)

  • Authors:
  • Autor USP: BARONI, LUCIANA - FCFRP
  • Unidade: FCFRP
  • Sigla do Departamento: 602
  • Subjects: FARMÁCIA; NEOSPORA CANINUM; ACTINAS; APICOMPLEXA; PROTEÍNAS
  • Keywords: Actin; Actin-binding proteins (ABP); Actin-depolimerising factor (ADF/cofilin); Cyclase-associated protein (CAP); Fator de despolimerização de actina (ADF/cofilina); Neospora caninum; Proteína associada a ciclase (CAP); Proteínas que se ligam a actina (ABP)
  • Language: Português
  • Abstract: Neospora caninum é um parasita intracelular obrigatório pertencente ao filo Apicomplexa, conhecido por ser uma das principais causas de aborto parasitário em bovinos e por apresentar transmissão transplacentária. Para locomoverem-se e acessarem o conteúdo intracelular de células hospedeiras, organismos apicomplexas fazem uso de um mecanismo não convencional que se utiliza de uma maquinaria celular cujo papel central é exercido pelo motor actina-miosina, auxiliado por proteínas intermediárias e de acoragem, que realiza a propulsão do parasita na direção do movimento. Para o funcionamento dessa maquinaria, é essencial que actina esteja em sua forma filamentosa (actina-F). Porém, actinas de apicomplexas são conhecidas por serem funcional e estruturalmente não convencionais, formando filamentos pequenos e instáveis in vitro, assim como pelo predomínio de grande maioria de actina monomérica (actin-G) nas células in vivo. Desse modo, para formar e manter actina-F a dinâmica de actina desses organismos requer uma regulação precisa, que, em apicomplexas, é conduzida por um arsenal conhecidamente pequeno de proteínas que se ligam a actina (ABPs). Nosso objetivo neste estudo foi identificar e caracterizar ABPs de N. caninum. Para isso, duas ABPs de N. caninum foram estudadas: fator de despolimerização de actina (NcADF) e proteína associada a ciclase (NcCAP); também, foi gerado e caracterizado soro contra região de actina de N. caninum entre aminoácidos 201 e 310 (anti-NcAct201-310).NcADF (correspondente ao acesso NCLIV_012510 em ToxoDB) foi submetida a caracterização molecular e bioquímica. A sua estrutura terciária foi gerada por modelagem molecular baseada em homologia, apresentando folding conservado, porém com F-loop de menor tamanho, quando comparada a ADF/cofilinas canônicas. A forma recombinante de NcADF foi expressa E. coli BL21 por plasmídeos pET32a(+) e pET28a(+) e solubilizada em tampão desnaturante e nativo, respectivamente. NcADF_pET32 foi purificada e utilizada para geração de soro anti-NcADF, que detectou ambas NcADF recombinantes, assim como proteínas endógenas em western blot 1-D e 2-D com peso molecular e pI próximos aos preditos. O soro anti-NcADF também localizou NcADF difusa no citoplasma, com menos intensidade nos polos de taquizoítas de N. caninum extracelulares. NcADF_pET28 foi purificado na forma nativa e utilizado para caracterização funcional para avaliação de seu papel na dinâmica de actina liofilizada de coelho. Ensaios de cossedimentação, cinética de polimerização e despolimerização, viscosimentria de baixo cisalhamento (queda de bola), estado estacionário e ligação entre actina-G e NcADF, em conjunto, mostraram que NcADF causa despolimerização de actina-F, realiza sequestro de monômeros de actina e quebra de filamentos. NcCAP foi submetida a caracterização molecular e foi identificada como produto de expressão do gene de acesso NCLIV_054140. NcCAP recombinante foi expressa em pET32a(+) e pET28a(+) predominantemente emcorpos de inclusão e foi solubilizada em tampão desnaturante. A forma purificada de pET32_NcCAP, identificada por espectrometria de massas, foi utilizada para imunização e o soro resultante detectou NcCAP recombinante e endógena por western blot 1-D e 2-D, apresentando bandas e spots de peso molecular e pI próximos ao esperado. O soro anti-NcCAP também localizou NcCAP em taquizoítas ii extracelulares de N. caninum difusa no citoplasma e/ou com predomínio na região periplasmática da célula. Por fim, o soro anti-NcAct201-310 foi gerado, sendo capaz de detectar proteínas em sua forma nativa e realizar marcação na região periférica e, possivelmente, nuclear de taquizoítas de N. caninum extracelulares. A caracterização de ABPs de N. caninum feita neste trabalho amplia o conhecimento sobre a conservação dessas proteínas ao longo do filo Apicomplexa. Ademais, representa uma contribuição para o entendimento da dinâmica de actina e, por consequência, futuramente, pode colaborar para a elucidação de mecanismos-chave para a sobrevivência e disseminação dos parasitas pelo seu hospedeiro
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  • Data da defesa: 26.04.2017
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    • ABNT

      BARONI, Luciana; NATSUI, Ana Patricia Yatsuda. Identificação e caracterização de proteínas que se ligam a actina (ABPs) no apicomplexa Neospora caninum. 2017.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-03072017-082155/ >.
    • APA

      Baroni, L., & Natsui, A. P. Y. (2017). Identificação e caracterização de proteínas que se ligam a actina (ABPs) no apicomplexa Neospora caninum. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-03072017-082155/
    • NLM

      Baroni L, Natsui APY. Identificação e caracterização de proteínas que se ligam a actina (ABPs) no apicomplexa Neospora caninum [Internet]. 2017 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-03072017-082155/
    • Vancouver

      Baroni L, Natsui APY. Identificação e caracterização de proteínas que se ligam a actina (ABPs) no apicomplexa Neospora caninum [Internet]. 2017 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-03072017-082155/

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