Edição do gene TFAM pela engenharia CRISPR Cas9 em modelo bovino (2016)
- Authors:
- Autor USP: OLIVEIRA, VANESSA CRISTINA DE - FMVZ
- Unidade: FMVZ
- Sigla do Departamento: VCI
- Subjects: MITOCÔNDRIAS; DNA MITOCONDRIAL; FIBROBLASTOS; BOVINOS; RNA
- Keywords: Bovine; Bovino; CRISPR Cas9; CRISPR Cas9; Mitochondria; TFAM; TFAM
- Language: Português
- Abstract: O fator de transcrição A mitocondrial (TFAM) é um membro da subfamília HMGB que se liga a promotores do DNA mitocondrial (mtDNA). >> um gene importante para a manutenção do mtDNA, pois regula o número de cópias e é essencial para inicialização da replicação e transcrição do mtDNA. Recentemente técnicas de edição gênica vêm sendo utilizada como uma ferramenta bastante eficaz na manipulação genômica. A nova tecnologia chamada de CRISPR/ Cas9 (Regulary interspaced clustered short palindromic repeats) utiliza um RNA guia (gRNA) curto que contém 20 nucleotídeos complementares a sequência de DNA. Quando o RNA guia se liga ao local alvo, a proteína Cas9 é recrutada para se ligar no local alvo e induzir a dupla quebra na cadeia de DNA. Neste contexto, este estudo propôs editar o gene TFAM pela tecnologia CRISPR Cas9, com o objetivo de gerar células Rho zero através do knock-out em fibroblastos bovinos. Os fibroblastos bovinos utilizados neste estudo foram derivados de uma biopsia de pele coletada de animais adultos. A sequência do gene foi obtida a partir do banco de dados GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) e esta foi inserida no site CRISPR direct (crispr.dbcls.jp) e no site rgenome (rgenome.net) a fim de desenhar o gRNA. O gRNA foi desenhado no exon 1 do gene TFAM bovino. Os fibroblastos foram cultivados e após as células atingirem 80% de confluência, estas foram eletrotransfectadas com Cas9 (Addgene 48668), gRNA, GFP e plasmídeo controle. Foi utilizado o kit Primary MammalianFibroblasts (VPI-1002) e a transfecção foi realizada no equipamento AMAXA Nucleofector 2B. Após a transfecção foi realizada a citometria de fluxo para avaliar a taxa de transfecção, e as células pós transfectadas foram plaqueadas em placas de 96 poços, pela técnica de sorting. O sorting separarou uma célula por poço de 96. Após 20 dias em cultura essas células foram tripsinizadas em placas de 6 poços e o DNA genômico foi extraído, utilizando o kit Qiamp DNA microkit-Qiagen. Para avaliar a frequência de mutações, foi realizada a digestão com a enzima T7 endonuclease, e após confirmado mutações, os clones foram enviados para analise de sequenciamento. Observamos uma taxa de transfecção eficiente de 51,3%. Obtivemos 40 clones com DNA extraído para analise, no qual 7 destes possuiam mutações no local de inserção da CRISPR Cas 9. Com isso, concluimos uma heterozigose mostrando que o desenho da CRISPR foi eficiente, gerando uma deleção do gene TFAM
- Imprenta:
- Data da defesa: 19.12.2016
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ABNT
OLIVEIRA, Vanessa Cristina de. Edição do gene TFAM pela engenharia CRISPR Cas9 em modelo bovino. 2016. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2016. Disponível em: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10132/tde-20032017-162120/. Acesso em: 16 abr. 2026. -
APA
Oliveira, V. C. de. (2016). Edição do gene TFAM pela engenharia CRISPR Cas9 em modelo bovino (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de https://teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10132/tde-20032017-162120/ -
NLM
Oliveira VC de. Edição do gene TFAM pela engenharia CRISPR Cas9 em modelo bovino [Internet]. 2016 ;[citado 2026 abr. 16 ] Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10132/tde-20032017-162120/ -
Vancouver
Oliveira VC de. Edição do gene TFAM pela engenharia CRISPR Cas9 em modelo bovino [Internet]. 2016 ;[citado 2026 abr. 16 ] Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10132/tde-20032017-162120/
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