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Avaliação in vitro da entrega do gene da glicoproteína do vírus da raiva através de vetores não virais (2016)

  • Authors:
  • USP affiliated author: ASTUDILLO, DANIELA FLORES TERUYA - EP
  • School: EP
  • Sigla do Departamento: PQI
  • Subjects: GLICOPROTEÍNAS; VACINAS; VÍRUS; RAIVA
  • Language: Português
  • Abstract: Um dos principais limitantes ao desenvolvimento e aprovação para utilização em humanos das vacinas de DNA é a falta de um vetor ideal de entrega gênica, que seja ao mesmo tempo eficiente e seguro. Embora mais seguros, os vetores não virais enfrentam uma série de barreiras físicas, enzimáticas e difusionais que limitam a chegada do transgene ao núcleo das células alvo. Dando continuidade ao trabalho desenvolvido em nosso grupo de pesquisa, o principal objetivo desta dissertação de mestrado foi avaliar o desempenho do vetor não viral comercial Lipofectamina e da proteína multifuncional T-Rp3 na entrega do gene da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) a células BHK-21. Primeiramente, o gene RVGP foi inserido no plasmídeo modelo pVAX1. Foram então realizados estudos de transfecção em células BHK-21 (Baby Hamster Kidney), utilizando-se Lipofectamina como agente de transfecção, no sentido de constatar a correta expressão do gene RVGP contido no novo plasmídeo. Como controle positivo, foi utilizado o plasmídeo pCMV-RVGP. Os estudos de PCR quantitativo da transcrição reversa (qRT-PCR) e imunofluorescência indicaram a expressão da glicoproteína pelo pVAX1RVGP, ainda que em valores de expressão menores se comparados com o plasmídeo controle pCMV-RVGP. Foi também desenvolvido com sucesso um método quantitativo de determinação da expressão da RVGP em células utilizando-se citometria de fluxo, que confirmou os resultados anteriores. Devido ao plasmídeo pVAX1RVGP ter apresentado baixa eficiência de expressão da RVGP, buscou-se a elevação da eficiência a partir da adição da sequência de KOZAK no plasmídeo pVAX1RVGP. Nesse caso, ainda que os resultados indiquem um aumento na expressão, não houve confirmação estatística (p<0,05). Os estudos de entrega com a proteína T-Rp3 foram realizados com um lote da T-Rp3 armazenada em ultrafreezer.A proteína demonstrou-se não ser estável após o congelamento em nitrogênio líquido e armazenamento em ultrafreezer pelo tempo de 10 meses. Apesar de ser capaz de complexar o pDNA após esse tempo, não foi eficiente em ensaios de transfecção, tendendo a agregar em relações molares altas e ausência de soro fetal bovino.
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 13.12.2016
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    • ABNT

      ASTUDILLO, Daniela Flores Teruya. Avaliação in vitro da entrega do gene da glicoproteína do vírus da raiva através de vetores não virais. 2016. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2016. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/3/3137/tde-20062017-111514/pt-br.php. Acesso em: 25 jun. 2022.
    • APA

      Astudillo, D. F. T. (2016). Avaliação in vitro da entrega do gene da glicoproteína do vírus da raiva através de vetores não virais (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/3/3137/tde-20062017-111514/pt-br.php
    • NLM

      Astudillo DFT. Avaliação in vitro da entrega do gene da glicoproteína do vírus da raiva através de vetores não virais [Internet]. 2016 ;[citado 2022 jun. 25 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/3/3137/tde-20062017-111514/pt-br.php
    • Vancouver

      Astudillo DFT. Avaliação in vitro da entrega do gene da glicoproteína do vírus da raiva através de vetores não virais [Internet]. 2016 ;[citado 2022 jun. 25 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/3/3137/tde-20062017-111514/pt-br.php


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