Expressão de crotamina recombinante em Escherichia coli (2017)
- Authors:
- Autor USP: LEINMULLER, MILENA DE MELLO CAMPOS - BIOTECNOLOGIA
- Unidade: BIOTECNOLOGIA
- Subjects: ESCHERICHIA COLI; PROTEINAS RECOMBINANTES; VENENOS DE ORIGEM ANIMAL; PROTEINAS; CÉLULAS CULTIVADAS DE TUMOR
- Keywords: Crotalus durissus terrificus; Crotalus durissus terrifucus; Citoplasma; Crotamina; Crotamine; Cytoplasm; Expession; Expressão; Periplasm; Periplasma
- Language: Português
- Abstract: Os venenos de serpentes contém uma mistura complexa de toxinas (proteínas e enzimas) que destroem os processos bioquímicos ou fisiológicos da presa. A crotamina é um dos principais componentes do veneno da cascavel Sul Americana Crotalus durissus terrificus. Essa proteína pertence à família dos polipeptídeos miotóxicos de baixo peso molecular (SBMPs). Uma importante atividade da crotamina é a habilidade de penetrar rapidamente em células proliferamente ativas, podendo ser usada como nanocarreadora, levando DNA plasmidial e drogas para dentro de células tumorais. Outra atividade interessante desta toxina é a indução de morte celular dose dependente em células cancerígenas proliferamente ativas sem prejudicar células normais, demonstrando promissora atividade anticâncer. A crotamina apresenta forte atividade antifúngica e moderada atividade contra procariotos, age bloqueando canais de potássio dependente de voltagem, sendo seletiva para os canais Kv1.1, Kv1.2 e Kv1.3, e induz paralisia dos membros posteriores de camundongo. Dada a importância das atividades da crotamina, a toxina foi usada para produzir na forma recombinante. De forma geral, as toxinas animais são peptídeos secretados para o lúmen da glândula de veneno e são ricos em pontes dissulfeto, comumente expressas em sistemas procarióticos na forma de corpúsculos de inclusão ou em sistemas de expressão periplasmática. Foram construídos três genes sintéticos, um para a expressão em citoplasma e dois para a expressão em periplasma bacteriano utilizando o vetor pRSET-A (Invitrogen ®).Para a expressão de crotamina em citoplasma bacteriano, a região do DNA que codifica a região do peptídeo maduro foi clonada em fusão com uma cauda simples de 6 x His separada por uma seqüência codificante do sítio de clivagem de enterokinase em substituição à proteína de fusão do vetor comercial pRSETA. Para a expressão em periplasma a região codificante da crotamina madura foi clonada sob o controle da seqüência sinal da OmpA de E. coli. Todos os códons raros da crotamina madura foram otimizados de acordo com os códons preferenciais de E. coli. Em uma das construções para a expressão em periplasma, além da crotamina madura, o peptídeo sinal de OmpA também teve seus códons raros otimizados. Os plasmídeos desenhados para a expressão da crotamina madura em citoplasma e periplasma foram transformados em bactéria competente BL21(DE3) e BL21-AI e a indução da proteína foi feita por IPTG e arabinose, respectivamente. A expressão foi analisada por SDS-PAGE e Western Blotting, mostrando que foi possível expressar as três construções em BL21-AI
- Imprenta:
- Data da defesa: 08.03.2017
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ABNT
LEINMULLER, Milena de Mello Campos. Expressão de crotamina recombinante em Escherichia coli. 2017. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-24052017-100121/. Acesso em: 21 out. 2024. -
APA
Leinmuller, M. de M. C. (2017). Expressão de crotamina recombinante em Escherichia coli (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-24052017-100121/ -
NLM
Leinmuller M de MC. Expressão de crotamina recombinante em Escherichia coli [Internet]. 2017 ;[citado 2024 out. 21 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-24052017-100121/ -
Vancouver
Leinmuller M de MC. Expressão de crotamina recombinante em Escherichia coli [Internet]. 2017 ;[citado 2024 out. 21 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-24052017-100121/
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