Efeito da reprogramação por indução à pluripotência (iPS) na manutenção do imprinting genômico celular (2016)
- Authors:
- Autor USP: BORGES, CAMILA MARTINS - FMVZ
- Unidade: FMVZ
- Sigla do Departamento: VCI
- Subjects: BOVINOS; IMPRINTING; REPROGRAMAÇÃO NUCLEAR
- Keywords: Cattle; Cellular reprogramming; Epigenética; Epigenetics; H19/IGF2; H19/IGF2; iPS; iPS; OCT4; OCT4; Reprogramação celular; SOX2; SOX2
- Language: Português
- Abstract: Biotecnologias reprodutivas como a produção in vitro de embriões e a transferência de núcleo apresentam grande potencial de aplicação na medicina veterinária seja para a correção de infertilidades, para o aumento na eficiência da produção animal ou mesmo para um melhor entendimento sobre os mecanismos envolvidos no desenvolvimento embrionário inicial. Porém, manipulações in vitro de gametas ou embriões levam a alterações na regulação epigenética, podendo causar altas taxas de anormalidades no desenvolvimento e no nascimento de indivíduos derivados. A geração de um modelo de indução da pluripotência in vitro, ou seja, a geração de células iPS (do inglês induced pluripotent stem cells) possibilitou estudar o processo de reprogramação in vitro de maneira robusta e precisa. Os genes OCT4 e SOX2 são fundamentais no processo de aquisição e manutenção da pluripotência celular, e recentemente foi reportado que a ação destes dois fatores exerce grande influência sobre a regulação de alguns genes imprinted, em especial, no locus H19/IGF2, sabidamente importantes para o desenvolvimento normal do embrião e de sua placenta. Este estudo propõe a geração de um modelo experimental in vitro onde os fatores em questão sejam estudados, juntos ou em combinação, quanto à sua influência na regulação do imprinting genômico. Para tal, três linhagens de fibroblastos fetais bovinos (bFF1, bFF2 e bFF3) foram transduzidas com vetores lentivirais contendo cDNAs de OCT4 ou SOX2 humanos. Os fibroblastosforam analisados através de citometria e as células positivas foram separadas e recuperadas (sorted). Os fibroblastos expressando OCT4, SOX2, ambos (OCT4 + SOX2), nenhum (controle) juntamente com um controle recuperado (não sorted) não transgênico (total de cinco tratamentos) foram investigados quanto à expressão de genes relacionados à pluripotência e expressão de genes imprinted, bem como a manutenção dos padrões de metilação do DNA no locus H19/IGF2. Além disso, estas células foram submetidas à reprogramação in vitro e produção de células iPS. A indução à pluripotência foi realizada através da transdução dos fibroblastos com o vetor policistrônico contendo o cDNAs murino ou humano dos fatores de transcrição OCT4, SOX2, c-MYC e KLF4 (OSMK, vetor STEMCCA). Os resultados da análise de fluorescência por citometria de fluxo foram, em média, de 40,4% para OCT4, 6,1% para SOX2 e 0,63% para OCT4 + SOX2. A bFF1 foi a única linhagem a apresentar uma recuperação pós-sorting, o que possibilitou sua utilização para a indução da pluripotência. De maneira interessante, as células que não passaram pela citometria geraram colónias de células iPS, enquanto que os demais grupos não. A quantificação de transcritos por qRT-PCR mostrou que a expressão de OCT4 e de SOX2 estava aumentada nos respectivos grupos, a expressão do gene H19 mostrou-se aumentada no grupo controle que passou pelo procedimento de sorting e a expressão do gene imprinted IGF2R não variou entre os grupos. Já a análisepreliminar da manutenção do padrão de metilação de DNA na DMR do locus H19/IGF2 mostrou que o grupo controle sorted apresentou uma leve diferença no padrão de metilação quando comparada aos outros grupos. Neste estudo, portanto, o procedimento de separação e recuperação celular por citometria de fluxo celular, aliado ao elevado número de repiques celulares durante o cultivo prolongado pode ter levado a um efeito prejudicial sobre a eficiência de reprogramação in vitro
- Imprenta:
- Data da defesa: 28.11.2016
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ABNT
BORGES, Camila Martins. Efeito da reprogramação por indução à pluripotência (iPS) na manutenção do imprinting genômico celular . 2016. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2016. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10132/tde-16032017-141811/. Acesso em: 23 abr. 2024. -
APA
Borges, C. M. (2016). Efeito da reprogramação por indução à pluripotência (iPS) na manutenção do imprinting genômico celular (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10132/tde-16032017-141811/ -
NLM
Borges CM. Efeito da reprogramação por indução à pluripotência (iPS) na manutenção do imprinting genômico celular [Internet]. 2016 ;[citado 2024 abr. 23 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10132/tde-16032017-141811/ -
Vancouver
Borges CM. Efeito da reprogramação por indução à pluripotência (iPS) na manutenção do imprinting genômico celular [Internet]. 2016 ;[citado 2024 abr. 23 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10132/tde-16032017-141811/
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