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Estratégias para a produção de fator Vlll recombinante (FVlllr) em uma linhagem humana em condições de cultivo livres de soro e em suspensão (2016)

  • Authors:
  • Autor USP: CARON, ANGELO LUIS - FCFRP
  • Unidade: FCFRP
  • Sigla do Departamento: 602
  • Subjects: LINHAGEM CELULAR; FATOR VIII; HEMOFILIA
  • Keywords: Adaptação; Cultura em suspensão; Meio de cultura livre de soro fetal bovino; SK-Hep-1; Adaptation; Bovine serum free culture medium; Hemophilia A; Human cell line; Recombinant factor VIII; SK-HEP-1; Suspension culture
  • Language: Português
  • Abstract: A hemofilia A é uma doença ligada ao cromossomo X causada pela deficiência do fator Vlll da coagulação sanguinea (FVIII). O tratamento disponivel consiste na terapia de reposição da proteina do fator Vlll derivada do plasma (FVllldp) ou recombinante (FVlllr). Atualmente, dos 7 produtos recombinantes disponíveis no mercado, 6 são produzidos em linhagens celulares de roedores. A expressão dessa proteina em sistemas celulares não-humanos pode gerar uma molécula com perfil de modificações diferente do endógeno, podendo levar a reações imunogênicas e geração de inibidores anti-FVlllr. Em função disso, novas estratégias de produção têm sido avaliadas, como a utilização de células hospedeiras mais eficientes no que diz respeito ao potencial de expressão da proteína de interesse. Dentre as linhagens de interesse, a linhagem hepática SK-HEP-1 tem se destacado por apresentar altos niveis de expressão do FVlllr e potencial para o cultivo em suspensão em meios livres de soro fetal bovino (SFB). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de FVlllr na linhagem celular humana SK-Hep-1 comparando duas estratégias para o estabelecimento de processos de produção em condições livres de soro e em suspensão: Estratégia 1 - adaptação para tais condições da linhagem já modificada geneticamente e EstraKgia 2 - modificação gênica para a expressão da proteína já em células previamente adaptadas à tais condições. Para a estratégia 1, foram geradas duas linhagens recombinantes produtoras de FVlllr, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1 aderentes e em cultivas suplementados com SFB. Na caracterização da cinética e produção do FVlllr as linhagens apresentaram taxas especificas máxima de crescimento (μmax) de 0,064 e 0,0031 h-1 produzindo 1,0 e 0,78UI/mL de FVlllr, respectivamente. Diversos protocolos de adaptação foram empregados, entretanto,não foi possível obter sucesso na adaptação das linhagens recombinantes para condições livres de soro e em suspensão. Para a estratégia 2, as células SK-HEP-1 selvagens adaptadas ao meio de cultura livre de SFB SFMII apresentaram um valor de Umas de 0,01 86h-' e μmax de 1 ,9x1 06cels/m L. Para as etapas de modificação gênica da linhagem selvagem foram utilizados os mesmos vetares lentivirais empregados para a geração das células recombinantes aderentes, pLVmpsvFVlllB-Neo e pLVCMVFVlllB-GFP. Para o primeiro, não foi possível gerar uma linhagem produtora do FVlllr. Para o segundo, foi possível obter duas linhagens produtoras do FVlllr com 0.14 e 0.121U/mL de atividade pelo ensaio cromogênico. O presente trabalho mostrou que a linhagem humana Sk-Hep-1 é apropriada para a produção de altos níveis de FVlllr. No entanto, maiores esforços devem ser voltados ao desenvolvimento de meios de cultura livres de soro específicos para a linhagem para possibilitar a produção eficiente do FVlllr em suspensão em meios livre de soro
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 02.09.2016
  • Acesso à fonte
    How to cite
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    • ABNT

      CARON, Angelo Luis; ANTONIETTO, Kamilla Swiech. Estratégias para a produção de fator Vlll recombinante (FVlllr) em uma linhagem humana em condições de cultivo livres de soro e em suspensão. 2016.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2016. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60138/tde-11042017-160340/ >.
    • APA

      Caron, A. L., & Antonietto, K. S. (2016). Estratégias para a produção de fator Vlll recombinante (FVlllr) em uma linhagem humana em condições de cultivo livres de soro e em suspensão. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60138/tde-11042017-160340/
    • NLM

      Caron AL, Antonietto KS. Estratégias para a produção de fator Vlll recombinante (FVlllr) em uma linhagem humana em condições de cultivo livres de soro e em suspensão [Internet]. 2016 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60138/tde-11042017-160340/
    • Vancouver

      Caron AL, Antonietto KS. Estratégias para a produção de fator Vlll recombinante (FVlllr) em uma linhagem humana em condições de cultivo livres de soro e em suspensão [Internet]. 2016 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60138/tde-11042017-160340/

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