Caracterização bioquímica e avaliação in vitro da ativação de fibroblastos e do potencial leishmanicida de uma L-aminoácido oxidase (LAAO) da peçonha de Crotalus durissus terrificus (2016)
- Authors:
- Autor USP: WIEZEL, GISELE ADRIANO - FCFRP
- Unidade: FCFRP
- Sigla do Departamento: 604
- Subjects: CITOTOXINAS; FIBROBLASTOS
- Keywords: Crotalus durissus terrificus; LAAO; Flavoproteínas; Modificações póstraducionais; Estabilidade térmica; Citotoxicidade; Atividade leishmanicida; Crotalus durissus terrificus. LAAO. Flavoproteins. Post-translational modifications. Thermal stability. Cytotoxicity. Leishmanicide activity
- Language: Português
- Abstract: Acidentes causados por animais peçonhentos representam um grave problema de saúde pública, principalmente em áreas de difícil acesso da população ao serviço de saúde. No Brasil, o gênero Crotalus é o gênero de serpente cuja peçonha apresenta o maior índice de letalidade. As L-aminoácido oxidases (LAAOs) estão presentes na peçonha crotálica e são flavoenzimas que catalisam a oxidação de L-aminoácidos, produzindo, concomitantemente, peróxido de hidrogênio e amônia. LAAOs têm demonstrado atividade citotóxica, antimicrobiana, antitumoral, antiparasitária e na agregação plaquetária. Os objetivos desse estudo incluíram o isolamento e a caracterização bioquímica da LAAO de C. d. terrificus, assim como a avaliação de seu potencial leishmanicida e da ativação de fibroblastos. Foram desenvolvidos dois protocolos para isolamento da LAAO. O primeiro consistiu em cromatografias de troca catiônica, filtração molecular e de interação hidrofóbica. O segundo protocolo diferiou do primeiro na terceira etapa (cromatografia de afinidade). Cromatografia de fase reversa da LAAO isolada demonstrou um alto grau de pureza e a separação do cofator FAD. A massa molecular da LAAO foi determinada por espectrometria de massas MALDITOF (58.702,196 Da). A caracterização estrutural dessa LAAO também incluiu a dedução da sua sequência primária e a localização do sítio de glicosilação e das ligações dissulfeto através de espectrometria de massas em equipamentos LC-MS/MS com diferentes tipos de fragmentação(HCD, ETD e EThcD). A sequência primária (498 resíduos) foi obtida após digestão da LAAO com diferentes proteases e o sítio de glicosilação foi localizado na Asn361. Análise por SDS-PAGE da LAAO em condições reduzida e reduzida/deglicosilada mostrou que cerca de 5% da massa da proteína é relativa à presença de açúcar. As ligações dissulfeto (Cys10-Cys171 e Cys331-Cys412) foram localizadas após digestão da enzima em pH ácido e análise por LC-MS/MS. A avaliação qualitativa da especificidade de substratos mostrou preferência por L-aminoácidos hidrofóbicos e, a ordem de especificidade (L-Phe>LLeu> L-Met>L-Trp>L-Ile) foi determinada através da cinética enzimática. A estabilidade da LAAO foi avaliada em diferentes temperaturas, tempos e condições de armazenamento. A enzima mostrou grande perda de atividade ao longo do tempo, sendo que a liofilização e o congelamento a -20 °C inibiram sua atividade completamente. A estabilidade térmica, avaliada pela técnica do Termofluor, mostrou que a LAAO é mais estável na presença de pH ácido, diferentes concentrações de substratos e ausência de NaCl. Promastigotas de Leishmania amazonensis foram estimulados com a LAAO (55 mUAE) e cerca de 30% dos parasitas foram mortos. Fibroblastos L929 também foram estimulados com a LAAO e em baixa concentração da enzima (1,83 mUAE) a viabilidade celular foi próxima de zero. Nas concentrações sem morte celular significativa, a ativação dos fibroblastos foi avaliada através da dosagem de óxido nítrico ecitocinas, mas, em nenhum dos casos, houve ativação das células e maior produção desses compostos. Portanto, no presente estudo, foi isolada e caracterizada uma LAAO de C. d. terrificus que apresentou ação contra promastigotas de L. amazonensis e alta citotoxicidade para fibroblastos, sem causar a ativação dessas células
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2016
- Data da defesa: 02.09.2016
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ABNT
WIEZEL, Gisele Adriano; BRAGA, Eliane Candiani Arantes. Caracterização bioquímica e avaliação in vitro da ativação de fibroblastos e do potencial leishmanicida de uma L-aminoácido oxidase (LAAO) da peçonha de Crotalus durissus terrificus. 2016.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2016. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-24102016-163845/ >. -
APA
Wiezel, G. A., & Braga, E. C. A. (2016). Caracterização bioquímica e avaliação in vitro da ativação de fibroblastos e do potencial leishmanicida de uma L-aminoácido oxidase (LAAO) da peçonha de Crotalus durissus terrificus. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-24102016-163845/ -
NLM
Wiezel GA, Braga ECA. Caracterização bioquímica e avaliação in vitro da ativação de fibroblastos e do potencial leishmanicida de uma L-aminoácido oxidase (LAAO) da peçonha de Crotalus durissus terrificus [Internet]. 2016 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-24102016-163845/ -
Vancouver
Wiezel GA, Braga ECA. Caracterização bioquímica e avaliação in vitro da ativação de fibroblastos e do potencial leishmanicida de uma L-aminoácido oxidase (LAAO) da peçonha de Crotalus durissus terrificus [Internet]. 2016 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-24102016-163845/ - Expressão heteróloga em Pichia pastoris da forma recombinante de uma toxina da peçonha de Tityus serrulatus
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