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Produção de L-asparaginase (ASP3) de Saccharomyces cerevisiae expressa em Pichia pastoris (2016)

  • Authors:
  • Autor USP: PILLACA PULLO, OMAR SANTIAGO - FCF
  • Unidade: FCF
  • Sigla do Departamento: FBT
  • Subjects: FARMÁCIA; BIOTECNOLOGIA; LEVEDURAS; REATORES BIOQUÍMICOS; LEUCEMIA
  • Language: Português
  • Abstract: A enzima L-asparaginase (ASNase) usada como biofármaco no tratamento de Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) é de origem bacteriana, o que provoca reações imunológicas nos paciente e a ASNase usada no Brasil é importada o que dificulta seu uso por razões de abastecimento e de preço. Por outra parte, dentro dos sistemas de expressão de proteínas recombinantes usados pela biotecnologia, destaca-se a Pichia pastoris, levedura metilotrófica de fácil manipulação, crescimento rápido, alta capacidade de expressão e capaz de realizar modificações pós-traducionais. Neste projeto, o gene de ASNase II de Saccharomyces cerevisiae foi expressa em P. pastoris (´MutPOT.s´), tendo sido analisada a localização da enzima nos meios extracelular, intracelular e espaço periplasmático. Além disso, foram avaliadas diversas condições de crescimento e indução da ASNase em agitador orbital e finalmente foi feito o cultivo em biorreator de 3L operado em batelada. Segundo o analise da expressão, a enzima foi localizada no espaço periplasmático. O crescimento de P. pastoris em diferentes concentrações de glicerol (10,0 - 50,0 ´LPOT.-1´ ) mostraram parâmetros cinéticos similares (µmáx = 0,35; tg= 2,0 h) e o maior fator de conversão de substrato em células (Y x/s = 0,9 g ´GPOT.-1´ ) foi obtido com 10,0 g.´LPOT.-1´ de glicerol. A expressão de ASNase somente ocorreu a 20 °C e melhora com concentrações de metanol acima de 1,0% (v/v), obtendo-se a maior produção da enzima a 3% de metanol durante 48 horas, o que foi corroborado pelo planejamento fatorial fraccionado (´3POT.n-k´ + 2), n = 3 e k =1. Também se observou que o pH de indução, a suplementação com aminoácidos ou casaminoácidos e concentração de glicerol durante a fase de crescimento apresentaram pouca ou nenhuma influência na expressão. Entretanto, as células induzidas imediatamente após o glicerol ter sido consumido melhorarama produção de ASNase. No cultivo em biorreator, a fase de crescimento foi feita com 10,0 e 40,0 G.´L-1POT.-1´ de glicerol, e a fase de indução com pulsos de 3,0% (v/v) de metanol durante 120 horas. A maior atividade volumétrica (710,2 U. ´LPOT.-1´) de ASNase foi obtida na batelada com 40,0 g.´LPOT.-1´ de glicerol e a atividade periplasmática foi constante durante o tempo de cultivo o que significa que o controle do pH afeta positivamente na expressão de ASNase
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 20.09.2016
  • Acesso à fonte
    How to cite
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    • ABNT

      PILLACA PULLO, Omar Santiago; VITOLO, Michele. Produção de L-asparaginase (ASP3) de Saccharomyces cerevisiae expressa em Pichia pastoris. 2016.Universidade de São Paulo, São Paulo, 2016. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-08112016-120926/ >.
    • APA

      Pillaca Pullo, O. S., & Vitolo, M. (2016). Produção de L-asparaginase (ASP3) de Saccharomyces cerevisiae expressa em Pichia pastoris. Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-08112016-120926/
    • NLM

      Pillaca Pullo OS, Vitolo M. Produção de L-asparaginase (ASP3) de Saccharomyces cerevisiae expressa em Pichia pastoris [Internet]. 2016 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-08112016-120926/
    • Vancouver

      Pillaca Pullo OS, Vitolo M. Produção de L-asparaginase (ASP3) de Saccharomyces cerevisiae expressa em Pichia pastoris [Internet]. 2016 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-08112016-120926/

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